木薯葉致突變作用研究

楊 娟，丁曉雯，*，龍 悅，黃先智

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，重慶400716;2.西南大學(xué)蠶學(xué)與系統(tǒng)生物研究所，重慶北碚400716)

木薯(Manihot esculenta Crantz)又稱木番薯、樹薯，地下部分結(jié)薯。人們種植木薯主要是為了獲取木薯根用來生產(chǎn)淀粉和酒精［1］。大量木薯莖、葉沒能得到充分的利用，尤其是木薯葉，它富含蛋白質(zhì)、維生素及礦物質(zhì)，其中蛋白質(zhì)含量在4.0%～9.6%之間，干葉中為 20.6% ～36.4% 之間［2－3］。因此木薯葉可以養(yǎng)蠶、作為蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑用于禽畜飼料［4－6］。但由于木薯莖葉中含有氰化物，其含量為58.9～162.3mg/kg鮮樣，占全株的2.1%［7］。一定量的氰化物進(jìn)入人和動物體內(nèi)，將導(dǎo)致組織細(xì)胞窒息，使木薯葉的利用存在一定的安全隱患［8］，相關(guān)報道［9－11］顯示，山羊、家兔、耕牛等動物進(jìn)食過量木薯葉后可發(fā)生氫氰酸中毒。由此可見，木薯葉存在著不可忽視的安全隱患，而現(xiàn)國內(nèi)外對于其安全利用的研究卻微乎其微。僅有報道稱用沸水處理可以降低木薯葉中氰化物的含量［12］。

本實驗室對木薯蠶進(jìn)行安全性分析時發(fā)現(xiàn)蠶蛹具有一定的致突變性，追其原因發(fā)現(xiàn)跟木薯葉相關(guān)。因此，實驗室對木薯葉進(jìn)行了安全性分析。在測定木薯葉氰化物含量基礎(chǔ)上，對木薯葉的遺傳毒性進(jìn)行了研究，以期實驗結(jié)果對木薯葉的安全利用提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆明種清潔級小白鼠，體重18～30g，重慶市中藥研究院動物研究所，許可證號SCXK(渝)2007－0006。

干木薯葉:西南大學(xué)蠶學(xué)與系統(tǒng)生物研究所提供，產(chǎn)地為廣西南寧。

甲醇(AR)成都科龍化工試劑廠;堿性品紅 溫州市東升化工試劑廠;環(huán)磷酰胺(AR)山西普德藥業(yè)有限公司;小牛血清 北京燕生政博生物科技有限責(zé)任公司;Giemsa染液 上海馨晟試化工科技有限公司;其他常用試劑均為分析純。

XSN－3G顯微鏡 重慶光電儀器有限公司;HH－8數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州歐化儀器有限公司;KQ5200DB超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司;RE52CS－1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 干木薯葉中氰化物含量的測定 按照參考文獻(xiàn)［13］的方法進(jìn)行測定。

1.2.2 蠶豆根尖微核試驗 稱取干木薯葉，粉碎加水，分別制成濃度為 1.58、3.16、6.32、15.80、31.59mg/mL 的木薯葉粉溶液，超聲30min(常溫，160W)，過濾，收集濾液備用。

蠶豆根尖微核試驗(micronucleus，MCN)的方法［14］:選擇飽滿、大小均勻的蠶豆種子，置于蒸餾水中浸泡26～30h使其吸脹，于25℃水浴鍋中恒溫培養(yǎng)。用制備好的濾液對蠶豆進(jìn)行染毒處理，同時做陽性對照(10.0μg/mL環(huán)磷酰胺溶液)處理和陰性對照(蒸餾水)處理。各處理組染毒6h之后，每組取發(fā)芽種子6～8粒，從根尖頂端切下1cm的幼根用卡諾固定液固定24h，置70%乙醇中，4℃冰箱保存。幼根經(jīng)過5mol/L鹽酸軟化，席夫氏試劑浸染，二氧化硫洗滌液浸洗，常規(guī)制片，顯微鏡觀察。每個處理觀察5個以上根尖，每個根尖至少觀察1000個間期細(xì)胞，統(tǒng)計細(xì)胞微核數(shù)，按下式計算微核率:

微核率(MCN)(‰)=某測試樣品(包括對照組)觀察到的MCN數(shù)/某測試樣品(或?qū)φ?觀察的細(xì)胞數(shù)×1000

試驗結(jié)果的判定:樣品的微核率與陰性對照的微核率進(jìn)行比較，如果差異有顯著性并且微核指數(shù)在1.5以上，認(rèn)為樣本具有致植物細(xì)胞突變的作用［15］。

1.2.3 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗 采用GB 15193.5－2003《骨髓細(xì)胞微核試驗》［16］。

選用健康昆明種小鼠60只，體重25～30g，隨機(jī)分成6組，每組10只小鼠，雌雄各半。設(shè)一個陰性對照組(蒸餾水)和一個陽性對照組(40mg/kg·bw環(huán)磷酰胺溶液)，木薯葉受試物分為四個濃度組，各組均以小鼠最大灌胃體積20mL/kg進(jìn)行灌胃，兩次灌胃時間間隔為24h。

于第2次灌胃后6h處死動物，取小鼠胸骨，去肉，用止血鉗擠出骨髓液與玻片一端的小牛血清混勻涂片，自然干燥后放入甲醇中固定5～10min，取出晾干。放入Giemsa應(yīng)用液中染色10～15min，立即用純水沖洗晾干。先以低倍鏡、高倍鏡粗檢，再用油鏡檢查計數(shù)。嗜多染紅細(xì)胞(PCE)呈灰藍(lán)色，成熟紅細(xì)胞(RBC)呈粉紅色，微核呈紫紅色或藍(lán)紫色。每張片計數(shù)1000個嗜多染紅細(xì)胞，并計算含微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)，微核率計算公式:

嗜多染紅細(xì)胞微核率(‰)=有微核的嗜多染紅細(xì)胞總數(shù)/嗜多染紅細(xì)胞總數(shù)×1000

用t檢驗比較各組供試小鼠微核率的差異［17－19］。與陰性對照組相比，若結(jié)果為顯著性差異或極顯著性差異，即p＜0.05或p＜0.01，則認(rèn)為樣本具有致動物體細(xì)胞突變的作用;若結(jié)果為p＞0.05，則說明樣本不具有致動物體細(xì)胞突變的作用。

1.2.4 小鼠精子畸形試驗 采用GB 15193.7－2003《小鼠精子畸形試驗》［20］。

選用健康昆明種成年雄性小鼠30只，體重25～35g，隨機(jī)分成6組，每組5只。設(shè)陰性對照組(蒸餾水)和陽性對照組(40mg/kg·bw環(huán)磷酰胺溶液)，木薯葉受試物分為四個濃度組。各組均以小鼠最大灌胃體積40mL/kg進(jìn)行灌胃，兩次灌胃時間間隔為24h。

連續(xù)灌胃5次，隨后飼養(yǎng)30d。飼養(yǎng)過程中自由攝食、飲水，于35d頸椎脫臼處死，分別取小鼠兩側(cè)附睪，制成精子懸液，常規(guī)涂片，甲醇固定，用1%的伊紅染色，于10×40倍顯微鏡下觀察形態(tài)。每張片觀察1000個頭、尾完整的精子，記錄畸形精子數(shù)，計算精子畸形率，計算公式如下。

試驗結(jié)果的判定是以樣品的精子畸變率與陰性對照的精子畸變率進(jìn)行比較，對比較結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。如果差異有顯著性，即認(rèn)為實驗樣品為陽性，可能具有一定的致突變性。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法 采用SPSS軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干木薯葉中氰化物的含量

木薯葉中含氰化物使其存在一定的安全隱患。測定結(jié)果顯示，實驗用木薯葉中氰化物含量為(5.26±0.59)mg/kg干樣，這與陳建新等［7］測定結(jié)果相差較大，原因可能實驗用木薯葉是烘干的，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)烘干可使木薯葉中氰化物的損失率達(dá)到50% ～70%［21］。

由此可計算出實驗設(shè)計中所取的不同濃度木薯葉中氰化物的含量，如表1～表3所示。

2.2 木薯葉對蠶豆根尖細(xì)胞微核率的影響

蠶豆根尖細(xì)胞微核試驗與染色體畸變實驗有良好的相關(guān)性［22］，蠶豆和動物之間對環(huán)境致突變物所引起的染色體畸變等定性反應(yīng)的一致性可達(dá)99%以上［23］，且蠶豆根尖微核試驗快速、簡便、重復(fù)性好和靈敏度高，現(xiàn)大量學(xué)者將蠶豆根尖微核試驗應(yīng)用于食品中化學(xué)物質(zhì)致突變性的檢測，作為一種方便快捷的體外試驗方法［24－26］。

表1 木薯葉的蠶豆根尖微核試驗結(jié)果Table 1 The results of Cassava leaves of broad bean root tip micronucleus test

表2 木薯葉致小鼠骨髓微核率試驗結(jié)果Table 2 The results of mouse bone marrow micronucleus on cassava leaf

木薯葉對蠶豆根尖細(xì)胞微核率的影響結(jié)果見表1。

從表1可以看出，木薯葉在1.58～31.59mg/mL實驗濃度范圍內(nèi)，對蠶豆根尖微核率的影響呈現(xiàn)明顯的劑量－效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)木薯葉樣品濃度為15.80、31.59mg/mL(氰化物含量為 83.03 ×10－6、166.05 ×10－6mg/mL)時，與陰性對照比較具有極顯著性差異(p＜0.01)且蠶豆根尖微核指數(shù)分別為1.77、2.16。由此判定當(dāng)木薯葉濃度大于15.80mg/mL以上，對蠶豆根尖細(xì)胞可能具有致突變作用。

2.3 木薯葉對小鼠骨髓細(xì)胞微核率的影響

小鼠骨髓微核試驗是通過測定骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核發(fā)生率以檢測細(xì)胞遺傳損傷的體內(nèi)微核試驗方法［22］。當(dāng)紅細(xì)胞受到外界誘變因子作用，成熟紅細(xì)胞發(fā)展為紅細(xì)胞時，主核排出，微核仍留在胞漿中。通過小鼠骨髓微核試驗，確認(rèn)木薯葉是否具有致哺乳動物體細(xì)胞突變性。

木薯葉對小鼠骨髓細(xì)胞微核率的影響結(jié)果見表2。

從表2中可知，陽性對照組中小鼠的骨髓微核率最高，與陰性對照組比較存在極顯著性差異(p＜0.01)，說明在此條件下實驗結(jié)果是可靠的。

在雌、雄性小鼠試驗中，木薯葉濃度為15.80和31.59mg/mL時，與陰性對照相比分別存在顯著性差異(p＜0.05)和極顯著性差異(p＜0.01)，而當(dāng)木薯葉濃度7.90和3.94mg/mL時，與陰性對照均不存在顯著性差異(p＞0.05)。

木薯葉在3.94～31.59mg/mL實驗濃度范圍內(nèi)，對小鼠骨髓微核率的影響呈現(xiàn)明顯的劑量－效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)木薯葉濃度超過15.80mg/mL以上，即木薯葉中氰化物含量高于83.03×10－6mg/kg時，可能對雌、雄小鼠的體細(xì)胞均具有致突變作用。

2.4 木薯葉的小鼠精子畸形試驗

通過觀察精子形態(tài)變化來判斷木薯葉對小鼠精子生成、發(fā)育的影響，判斷木薯葉對雄性生殖細(xì)胞的致突變作用。

木薯葉對小鼠精子畸形影響結(jié)果見表3。

如表3所示，陽性對照組對小鼠精子畸變率較陰性對照組存在顯著差異(p＜0.01)，說明在此條件下實驗結(jié)果是可靠的。

當(dāng)木薯葉濃度大于7.90mg/mL，與陰性對照組比均存在極顯著性差異(p＜0.01)。表明木薯葉濃度在7.90mg/mL以上，對小鼠生殖細(xì)胞可能具有致突變作用。

表3 木薯葉對小鼠精子畸變發(fā)生率的影響Table 3 Effects of cassava leaf on mouse sperm shape abnormality rates

3 結(jié)論

由此判定，當(dāng)木薯葉濃度超過7.90mg/mL(含氰化物濃度41.51×10－6mg/kg)時對小鼠生殖細(xì)胞可能具有致突變作用;木薯葉濃度超過15.80mg/mL(含氰化物83.03×10－6mg/kg)時對植物細(xì)胞、動物體細(xì)胞及動物生殖細(xì)胞均可能具有致突變作用。所以，在對木薯葉進(jìn)行使用的過程中，應(yīng)注意濃度的限制。另外，雖已證實木薯葉具有致突變作用，且對其有毒物質(zhì)氰化物進(jìn)行了測定，但仍不能完全確定其毒性是否與氰化物的含量有關(guān)，就木薯葉安全性考量，理應(yīng)進(jìn)一步確定木薯葉中氰化物的影響，進(jìn)一步確定木薯葉致突變性與其氰化物含量之間的關(guān)系。

目前，木薯葉作為飼料生產(chǎn)的過程中幾乎未經(jīng)過任何前處理，安全性極低，這應(yīng)該引起廣大學(xué)者的注意，找出恰當(dāng)?shù)那疤幚矸椒ㄓ糜谀臼砣~的開發(fā)利用。

國內(nèi)外學(xué)者提出，可利用木薯葉的營養(yǎng)保健功能開發(fā)木薯葉營養(yǎng)保健品，將其列為新的食物資源，而開發(fā)的過程中遇到諸如口感、安全性方面的問題，有待更多學(xué)者致力其中。

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