食品中空腸彎曲菌檢測技術最新進展

胡元慶，李鳳霞

(閩南師范大學生物科學與技術學院，福建漳州363000)

彎曲菌是一種革蘭氏陰性桿菌，能引起散發性和地方流行性的人類胃腸炎，特殊血清型的空腸彎曲菌對具有免疫缺陷性的人群，如癌癥病人、艾滋病病人、糖尿病人、小孩和老人等，危害更加嚴重［1］。彎曲菌性腸炎潛伏期約為17d，主要臨床癥狀包括發熱、腹痛、水樣或粘液血性腹瀉以及嘔吐等［2］。另外，空腸彎曲菌被認為是人類格林－巴利綜合征(Guillain－Barré syndrome，GBS)最主要的前驅致病因子［1］，發病主要是由于空腸彎曲菌的菌體成分可以與宿主的神經節苷酯發生分子模擬，導致病人神經麻痹甚至癱瘓，嚴重威脅到人類的健康［3－5］。20世紀 90年代國內對彎曲菌檢測的研究報道較少，主要由于彎曲菌病的發生較罕見，畜禽病死率低，以及彎曲菌培養條件比較苛刻等原因。近年來，彎曲菌的感染率在世界各地呈上升趨勢，特別是歐美發達國家的禽肉食品污染比較嚴重［6］。發展中國家空腸彎曲菌污染食品的案例報道相對較少，主要是引起部分人群的腹瀉及腸炎，但隨著我國經濟的發展和人民生活水平的提高，空腸彎曲菌污染肉類食品的事件逐年增多［6］。建立空腸彎曲菌快速特異的分離檢測方法，提高食品中空腸彎曲菌的檢出效率，可有效控制畜產品在生產和消費中受空腸彎曲菌的污染，有助于從根本上預防控制人畜共患空腸彎曲菌病的發生。本文將綜述空腸彎曲菌檢測方法及技術的最新研究進展。

1 常規分離鑒定方法

空腸彎曲菌的體外培養需要較為苛刻的條件，尤其要求嚴格的氣體環境。早在1957年King等就已發現彎曲菌與人類腸炎的發生密切相關，但直到Skirrow和Blaster使用能抑制腸道中背景菌群的培養基后，該屬細菌的檢出率才得以提高［7］。

彎曲菌常規分離鑒定方法包括增菌培養、選擇性分離和生化鑒定。革蘭氏染色、細菌動力觀察、過氧化氫酶試驗、氧化酶試驗等可將彎曲菌鑒定到屬的水平。而更精確的種特異性鑒定則需要做更多的生化試驗，如硝酸鹽水解試驗、馬尿酸鹽水解試驗、吲哚乙酸酯水解試驗、萘啶酸和頭孢菌素敏感性試驗等。確定彎曲菌的屬后，可使用API Campy生化鑒定試劑盒或VITEK－NH生化鑒定卡來進行種特異性鑒定［8］。近年來，還出現了 Micro－ID 系統、Enterotube系統和Mnitek系統等，從而使得空腸彎曲菌鑒定更簡易化、微量化和快速化。用生化方法鑒別空腸彎曲菌和結腸彎曲菌的唯一指標是馬尿酸鹽水解試驗，其中空腸彎曲菌馬尿酸鹽水解試驗呈陽性。也有報道顯示，約10% 的空腸彎曲菌分離株在實驗室培養條件下失去分解馬尿酸鹽的能力［9］。盡管生化方法是目前微生物學手段鑒定空腸彎曲菌的“金標準”，但實際應用中很難保證結果的準確性。

2 核酸檢測方法

2.1 基因芯片

基因芯片技術廣泛應用于基因序列分析、雜交、基因突變檢測和多態性分析、基因組文庫圖型分析以及疾病的基因診斷等領域。該技術可將大量不同的探針固定于同一支持物上，一次性對同一樣品進行序列監測和核酸分析［10－11］。Georgios Keramas 等［12］使用一種敏感的DNA芯片快速檢測泄殖腔拭子樣品中的彎曲菌。姜海等［13］利用細菌種屬特異性基因、重要毒力基因以及目前已經可區分菌株亞型的基因作為靶基因探針制備基因芯片，并通過雜交反應檢測常見腸道致病菌。王金玲等［14］依據 16S rRNA、23S rRNA上的恒定區和可變區設計7種致病菌的通用引物和特異性寡核苷酸探針，并對探針5'端氨基化修飾后與基因芯片共價結合，然后優化雜交反應液、芯片點樣及后處理程序，研制出能同時檢測動物性食品中7種主要致病菌的基因芯片。國內尤元海等［15］依據不同腸道病原菌毒力基因建立了一種基因芯片方法，可以檢測大腸桿菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、腸炎沙門菌、空腸彎曲菌、志賀氏菌和腸炎耶爾森氏菌，該技術具有高效快速實用等特點，尤其適合檢測腹瀉病人的感染菌。基因芯片技術雖然有多方面的優越性，但在實際應用中存在檢測成本高、設計要求嚴格等的局限性，所以不能廣泛用于基層單位的檢測工作。

2.2 多重PCR

多重PCR是在同一PCR反應體系中加上兩對或兩對以上的引物，同時擴增多個核酸片段的PCR反應，它具有高效、系統和經濟的特點，所以在多種病原微生物的同步檢測和鑒定方面得到廣泛應用。常選用的靶基因有16S rRNA基因、23S rRNA基因、鞭毛蛋白基因(flaA或flaB)、含鐵細胞轉運相關蛋白基因(ceuE)、細胞擴張毒素基因 cdt等［16］。Van Camp G H等［17］使用PCR的方法擴增彎曲菌的16S rRNA基因對該細菌進行鑒定。何蕊等［18］以16S rRNA、mapA和ceuE為靶基因，建立檢測空腸彎曲菌和結腸彎曲菌的多重PCR方法。同時使用該方法對180份生鮮雞肉樣品進行檢測，共檢測出空腸彎曲菌陽性樣品43份，結腸彎曲菌陽性樣品12份。結果表明，多重PCR方法具有快速、簡便、特異性強和靈敏度高等特點，可彌補傳統生化鑒定和血清學方法的不足，為彎曲菌檢測提供新的技術。國內侯建軍等［19］以空腸彎曲菌VS1基因的保守區設計引物，建立了能與其他食品污染菌相區別的PCR檢測方法，其靈敏度達6CFU/mL，該方法具有高效、靈敏、特異和穩定的特點。

近年出現了多重PCR的改進方法，如多重PCR－變性高效液相色譜(mPCR－ HPLC)［20］。與常規mPCR－凝膠電泳檢測技術不同，mPCR－HPLC經過PCR擴增后，使用DHPLC技術分辨分子大?。?1］。根據分子對固定相親和力的差異，用流動相洗脫時不同大小或者不同序列的核苷酸分子在固定相上移動速率不同檢測目的片段。該技術靈敏度和特異性較高，產物分子量1%大小的片段即能夠被分離檢出，克服了凝膠電泳檢測技術中產物條帶較弱，擴增片段大小相近時，難以肉眼準確判定結果的不足。Franciosa等［22］報道了利用變性高效液相色譜鑒定肉毒桿菌神經毒素A、B、E和F型基因的研究，并指出DHPLC技術可以用于食品病原微生物的檢測。曹際娟等［23］在國內首次報道了用DHPLC進行的微生物檢測研究，對動物源性飼料中沙門氏菌和志賀氏菌進行高通量檢測。徐君怡等［24］采用非變性DHPLC技術，建立了食品中空腸彎曲菌和結腸彎曲菌的特異性吸收譜圖，利用mPCR－DHPLC方法對彎曲菌進行快速檢測的研究。PCR技術與其它相關生物檢測手段聯合使用，是其發揮穩定性和特異性的新方向，未來開發的重點應是適合基層檢測應用的聯合新技術開發和優化，使檢測范圍進一步擴大，檢測成本保持較低水平。

2.3 套式PCR

套式PCR是用內、外兩套引物進行兩次PCR，第一次PCR產物作為第二次PCR的模板進行DNA擴增，該方法克服了一對引物擴增產量低而造成假陰性的缺點，大大提高了PCR擴增的靈敏度。高正琴等［25］建立了套式PCR檢測空腸彎曲菌的方法，并初步應用該方法對實驗動物空腸彎曲菌進行檢測，最低限度為10CFU/mL，整個檢測過程在8h內完成，從121份臨床樣品中共檢出31份陽性，與傳統的細菌分離方法一致。該方法與常規PCR方法相比，可從極少量模板中獲得高濃度和高純度的靶基因片段，其敏感性較常規PCR提高100倍以上。

2.4 PCR－ELISA

隨著生物技術的發展，人們不再滿足于PCR的定性測定，在凝膠電泳的基礎上使用掃描照片進行光密度分析，實現PCR的相對定量。但由于普通凝膠電泳檢測技術本身的特異性較低，只能對樣品進行粗略的相對定量。隨著固相捕獲技術的成熟和應用，尤其是酶聯免疫吸附試驗(ELISA)的成功，給核酸定量提供了一個新思路，固相捕獲的PCR－ELISA技術應運而生。經PCR擴增以后，在微孔板上借用ELISA的原理，用酶標抗體進行固相雜交來實現定量［26］。Sails A D 等［27］使用 CJ2 和CC2 兩個探針來檢測彎曲菌。用同一對引物擴增目的基因，PCRELISA的靈敏度比以凝膠為基礎的PCR高10～100倍，其靈敏度可達到1.5fg DNA。結果表明該方法具有高靈敏度、高特異性的特點，并大大降低了鑒定彎曲菌所需的時間，可用于食品和環境樣品中彎曲菌的檢測。

2.5 Real－time PCR

Real－time PCR即實時熒光定量PCR，是在PCR基礎上建立的一項新技術，由于它具有操作簡便、快速高效的特點，同時具有很高的敏感性和特異性，已被廣泛應用于多個領域。Real－time PCR在PCR指數擴增期間通過連續監測熒光信號強弱的變化來實時測定特異性產物的量，并據此推斷目的基因的初始量。該技術使用的熒光探針有分子信標、Taqman探針和SYBR Green I等。其中分子信標和Taqman探針法的熒光信號是特異的，檢測成本也較高;而SYBR Green I法中的熒光信號是非特異的，通過熒光染料與dsDNA的結合而發出熒光，繼而通過儀器自動檢測出熒光信號增長曲線［28］。

Chengbo Yang等［29］建立實時定量PCR方法檢測不經增菌處理的禽肉食品、牛奶和環境水樣中的彎曲菌。整個反應在1h之內完成，且最低檢出限為1CFU/mL。在300份禽肉樣品中檢出92份空腸彎曲菌陽性，300份牛奶樣品中檢出82份空腸彎曲菌陽性，300份環境水樣中檢出41份空腸彎曲菌陽性。Emma L.Best等［30］也建立了快速、特異、敏感的方法來對空腸彎曲菌和結腸彎曲菌進行檢測。Josefsen等［31］建立了一種細菌計數結合Real－time PCR檢測雞肉樣品中空腸彎曲菌的技術，可在3h內檢測到活的或者VBNC狀態的細菌，但不能檢測死亡彎曲菌的 DNA。Leblanc－Maridor M 等［32］建立了從糞便、食品和環境樣品中檢測空腸彎曲菌和結腸彎曲菌的Real－time PCR方法，其靈敏度可達10個基因組拷貝，能作為研究彎曲菌流行病學的可靠技術。

3 免疫學檢測方法

3.1 IMC－FPCR

免疫磁性分離技術(Immunomagnetic Separation，IMS)是以抗體包被的磁珠為載體，通過抗體與反應介質中特異性抗原結合形成抗原－抗體復合物，此復合物在磁場的作用下定向移動，從而達到分離抗原的目的。IMC－FPCR為磁珠捕獲－熒光PCR，它是應用抗血清和磁性微珠制備彎曲菌免疫磁珠，利用免疫磁珠來捕獲檢樣中目的菌的特定基因［33］。它具有簡便快速、靈敏度高、特異性強且抗干擾能力強等特點而得到應用，該方法可望解決非可培養狀態空腸彎曲菌檢測的難題。Liu G等［34］針對flaA基因hipO基因設計兩對引物，建立磁珠捕獲－熒光PCR檢測空腸彎曲菌的方法，對300份食品樣品和100份水樣品進行檢測，在食品樣品中檢測出4份陽性，結果與傳統的方法一致;在100份水樣品中檢測出1份陽性，而傳統方法沒有檢出陽性，同時該方法也可用于VBNC(存活非可培養)狀態下空腸彎曲菌的檢測。David F等［35］建立磁捕獲－熒光PCR對食品中的空腸彎曲菌進行檢測，可檢出的最少細菌數，比不用MS富集的方法低一個數量級。隨著科學的發展，免疫磁珠還可以與熒光定量PCR、ELISA、流式細胞術和免疫熒光顯微術等結合，實現特殊的檢測目的，為彎曲菌的檢測提供更加高效的手段。

3.2 ELISA

Taylor等［36］用空腸彎曲菌 NCTC11168的主要外膜蛋白制備了多價血清并建立了ELISA檢測方法，這種多價血清可以和空腸彎曲菌、結腸彎曲菌和海鷗彎曲菌三種彎曲菌反應。Griffiths等［37］利用種特異性多價血清建立了Dot－ELISA方法，可以區分空腸彎曲菌、結腸彎曲菌和海鷗彎曲菌。黎誠耀等［38］以方陣滴定法確定了空腸彎曲桿菌抗血清、酶結合物的最佳工作濃度和孵育時間，從而建立了快速檢測空腸彎曲菌的間接ELISA方法，對144份雞泄殖腔糞便標本和116份豬直腸糞便標本的選擇性增菌肉湯培養物進行了檢測，陽性率分別為83.3%和79.3%，可于28h內報告結果。黎誠耀等［39］還應用酶標抗體染色法檢測空腸彎曲菌，結果表明該方法具有較高的特異性及敏感性，在對47份雞糞便樣本和38株豬糞便樣本進行檢測時發現，其結果與常規細菌分離鑒定結果相同，該空腸彎曲菌的酶標抗體染色檢測法可在2h內完成。

另外，許多學者研制了針對彎曲菌多種抗原的單克隆抗體，以此建立ELISA的檢測方法。Monfort J D［40］建立了基于空腸彎曲菌和結腸彎曲菌鞭毛抗原單克隆抗體的ELISA方法，可以直接從泄殖腔棉拭子中檢測彎曲菌。Steele［41］制備了針對空腸彎曲菌馬尿酸鹽水解酶的單克隆抗體，結果表明其特異性較好。Brooks［42］制備了針對LPS的單克隆抗體，特異性較好。韓文瑜等［43］應用空腸彎曲菌共同抗原的單克隆抗體，以BA－ELISA法對雞和豬的胴體表面、臟器及泄殖腔樣本中的空腸彎曲菌進行檢驗，結果表明該方法具有較強的特異性和敏感性。

4 噬菌體受體蛋白捕獲技術

Amit Singh等［44］建立了用噬菌體受體結合蛋白捕獲空腸彎曲菌的技術，GP48RBP蛋白首先通過谷胱甘肽s－轉移酶融合蛋白的方式得以表達，然后被固定到等離子表面共振器上，用其捕獲待檢樣品中的細菌。結果表明:該技術具有較好的捕獲特異性，最低檢測限為102CFU/mL。后續的研究也將該技術與磁珠結合，用于捕獲未被濃縮的檢測樣品。Muhammad A.Javed等［45］對空腸彎曲菌的噬菌體NCTC12673全基因組進行了分析，確定了GP047是結合宿主的重要受體蛋白，對該蛋白C－端四分之一氨基酸區表達(CC GP047)，然后用其在玻片上積聚彎曲菌，這個積聚過程可以再幾分鐘內完成，其對彎曲菌的特異性識別達到100%，其中對空腸彎曲菌的特異性為95%，對結腸彎曲菌為90%。然后對CC GP047表達為綠色熒光融合蛋白，可以通過熒光顯微鏡來分析被吸附的彎曲菌。

5 展望

人感染彎曲菌的主要途徑是食用未煮熟的禽肉，通常為散發。彎曲菌病的爆發主要由飲用污染的水源或牛奶引起。由于空腸彎曲菌對環境的抵抗力較弱，不管是哪種途徑感染，污染的樣品攜帶空腸彎曲菌的數量都很低，給空腸彎曲菌的風險評估帶來一些困難。目前，較為實用的檢測方法是細菌分離培養配合PCR鑒定，檢測快速且成本相對較低，但經常有漏檢的情況發生。所以開發更靈敏、更特異、更快速的彎曲菌檢測方法是預防該菌感染人的重要手段。近年來，隨著分子生物學、免疫學、電化學的快速發展，尤其是幾種學科的交叉研究，新的彎曲菌檢測方法不斷產生。未來對空腸彎曲菌檢測方法的研究主要關注以下幾個方面:為克服細菌含量低而開發的新型富集方法和前增菌方法;空腸彎曲菌新的、更特異檢測抗原的發現;高通量檢測方法的建立，如基因芯片方法等。

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