范悅，吳曉光，趙泓翔，商亞珍

(河北省中藥研究與開發重點實驗室，承德醫學院中藥研究所，河北承德 067000)

半枝蓮黃酮對Aβ25-35引起的大鼠皮層星形膠質細胞NOS、HSP70及apoE異常表達的影響*

范悅，吳曉光，趙泓翔，商亞珍△

(河北省中藥研究與開發重點實驗室，承德醫學院中藥研究所，河北承德 067000)

目的:探討半枝蓮黃酮對Aβ25-35引起大鼠皮層星形膠質細胞一氧化氮合酶(NOS)熱休克蛋白70 (HSP70)及載脂蛋白E(apoE)蛋白表達異常變化的影響。方法：培養第3代的大鼠星形膠質細胞隨機分為空白對照組、模型組和3個劑量藥物組，藥物組細胞分別加入17.5、35和70 mg/L半枝蓮黃酮作用24 h后，模型組和3個劑量藥物組均加入Aβ25-35100 μmol/L作用24 h，免疫組化法測定星形膠質細胞中內皮型一氧化氮合酶(eNOS)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和神經元型一氧化氮合酶(nNOS)蛋白的表達;Western blotting檢測星形膠質細胞中HSP70蛋白的表達;RT-PCR測定細胞中apoE mRNA的表達。結果:與空白組相比，模型組eNOS蛋白含量降低60.83%(P＜0.01)，iNOS蛋白含量增加215.03%(P＜0.01)，HSP70蛋白含量增加166.67%(P＜0.01)，apoE mRNA含量增加150.00%(P＜0.01);半枝蓮黃酮17.5、35及70 mg/L能不同程度地提高eNOS蛋白含量73.66%～137.77%(P＜0.05)，降低iNOS蛋白含量19.40%～44.50%(P＜0.01)，降低HSP70蛋白含量18.52%～49.38% (P＜0.01)，降低apoE mRNA的含量14.17%～41.67%(P＜0.01)。結論:半枝蓮黃酮對Aβ25-35引起的大鼠皮層星形膠質細胞的損傷具有抑制作用。半枝蓮黃酮可能通過影響星形膠質細胞發揮對阿爾茨海默病的治療作用。

阿爾茨海默病;星形細胞;半枝蓮黃酮;一氧化氮合酶;熱休克蛋白70;載脂蛋白E類

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是最常見的癡呆類型，臨床上表現為進行性認知障礙和精神異常。AD的發病機制目前還不完全明確，但神經炎癥、氧化應激、膽堿能神經功能紊亂、免疫異常和基因遺傳等因素［1］都與之密切相關。Aβ是39～43個氨基酸殘基組成的肽段，Aβ25-35是其中的主要毒性片段，對體外培養及在體的神經細胞均有毒性［2］。

自一氧化氮(nitric oxide，NO)和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)被發現以來，對它的研究日益深入。大量的研究發現，NO不僅是在正常情況下與學習、記憶相關的信號分子，在異常的情況下也參與AD的發生和進展［3］。熱休克蛋白在細胞損傷修復方面有重要作用，目前對熱休克蛋白的研究也越來越得到研究人員的重視，體外實驗發現，熱休克蛋白70(heat-shock protein 70，HSP70)可以在早期階段抑制Aβ1-42的聚集［4］，抑制Aβ相關的毒性作用，故HSP70與AD的病理生理過程有密切聯系。載脂蛋白E(apolipoprotein E，apoE)也廣泛參與了AD發病的各個方面，包括Aβ的沉積、tau蛋白的異常磷酸化、神經原纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFTs)的形成、神經變性以及精神和行為缺陷等［5］。

星形膠質細胞作為數量最多的神經膠質細胞，與神經退行性疾病關系極為密切。目前對膠質細胞的影響隨著研究進展則越來越受到重視，因此，干預星形膠質細胞異常變化可能有利于神經退行性疾病的治療。

半枝蓮黃酮(Scutellaria barbata flavonoids，SBF)是從半枝蓮地上部分提取、分離的黃酮類化合物，現代藥理學發現其具有抗腫瘤、抗氧化和改善記憶障礙等多種藥理學作用［6-8］。其神經保護作用緣于其多羥基結構具有較強還原性，但對膠質細胞的影響未見報道，本研究利用Aβ25-35損傷星形膠質細胞體外模型，探討半枝蓮黃酮是否通過對星形膠質細胞的NOS、HSP70 及apoE表達的影響發揮抗癡呆作用。

材料和方法

1 動物和藥品

新生1～3 d的SD大鼠(合格證為No.90912)，雌雄不限，河北醫科大學實驗動物中心提供。半枝蓮黃酮承德醫學院中藥研究所提供。DMEM-F12培養基購于Gibco，胎牛血清購于PAA，胰蛋白酶購于華美生物工程有限公司。Aβ25-35購于上海強耀生物科技有限公司，NOS、HSP70Ⅰ抗購于北京博奧森生物技術有限公司。Ⅱ抗試劑盒、DAB顯色試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。ApoE(67 bp)上游引物5’-GCAGAGCTCCCAAGTCACACAG-3’，下游引物5’-TGCCTTTACTTCCGTCA-TAGTGTCC-3’;βactin(150 bp)上游引物5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’，下游引物5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3’;TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0(100次量)購于大連寶生物工程有限公司。

2 方法

2.1 星形膠質細胞培養新生1～3 d的SD大鼠，消毒，取出雙側大腦皮層，剔除腦膜及血管，剪碎，加入0.125%胰蛋白酶置于37℃、5%CO2培養箱中，孵育消化30 min，含20%胎牛血清的培養液終止消化。離心，以5×104cells/cm2的密度接種于用0.1%多聚賴氨酸包被的培養瓶中。30 min后輕輕翻轉培養瓶，吸出未貼壁的細胞懸液，重新接種于多聚賴氨酸包被的培養瓶中。培養3 d換液1次，培養10 d左右細胞長滿瓶底進行傳代。傳代第3代細胞利用免疫組化法對星形膠質細胞內特異性蛋白——膠質原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)進行細胞鑒定，通過隨機選取若干視野，陽性細胞計數，結果發現傳代第3代95%細胞為星形膠質細胞［9］。

2.2 Aβ25-35和半枝蓮黃酮的配制將Aβ25-35溶于三蒸水中過濾除菌，再與培養液混合配成200 μmol/L貯備液，分裝-20℃保存，使用前需置37℃溫箱孵育7 d以形成有神經毒性的聚集型Aβ25-35。半枝蓮黃酮溶于培養液中，配成100 mg/L貯備液，過濾除菌，分裝4℃保存。

2.3 Aβ25-35和半枝蓮黃酮的作用3代以上的細胞以5×104cells/well接種于24孔板內的0.1%多聚賴氨酸包被的蓋玻片上，37℃、5%CO2培養箱培養48 h后，分為空白對照組、模型組和半枝蓮3個劑量藥物組，3個劑量藥物組細胞加含17.5、35和70 mg/L半枝蓮黃酮的培養液，空白組和模型組細胞給予無血清培養液，培養24 h。隨后除空白組加無血清DMEM/F12培養液外，其余各組再加Aβ25-35使其終濃度為100 μmol/L，再培養24 h，進行指標的檢測。

2.4 星形膠質細胞中內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和神經元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)蛋白含量的檢測半枝蓮黃酮和Aβ25-35分組處理后，分別將細胞進行eNOS、iNOS和nNOS蛋白表達的常規免疫組化測定，I抗濃度1∶100，DAB顯色，脫水，透明，中性樹膠封片。同時用PBS代替Ⅰ抗作陰性對照。

2.5 星形膠質細胞中HSP70的檢測培養第3代的星形膠質細胞5×104cells/cm2的密度接種至培養瓶中，貼壁48 h后半枝蓮黃酮和Aβ25-35處理后，常規方法提取細胞總蛋白，電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，I抗為HSP70(1∶100)和β-actin(1∶500)，4℃孵育過夜，II抗(1∶3 000)孵育1 h，ECL發光液覆蓋3min后，暗匣曝光，顯影，定影。利用Quantity One 4.6.2軟件進行定量分析，以目的條帶吸光度與βactin條帶吸光度的比值作為HSP70蛋白表達的相對水平。

2.6 星形膠質細胞中apoE的檢測采用RT-PCR法檢測星形膠質細胞中的apoE的含量，培養至第3代的星形膠質細胞以5×104cells/cm2的密度接種至6孔板中，48 h后用半枝蓮黃酮和Aβ25-35處理，抽提總RNA，用DU800紫外可見分光光度計測定RNA濃度和純度。TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒進行反轉錄和PCR反應，PCR反應結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠于紫外透射儀中確認PCR反應產物并攝取圖像。利用Quantity One 4.6.2軟件進行定量分析，以目的條帶吸光度值與β-actin條帶吸光度值的比值作為各目的基因mRNA表達的相對水平。

3 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用統計軟件SPSS 17.0進行統計學分析，多樣本均數間比較采用One-way ANOVA，組間兩兩比較采用SNK檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 SBF對星形膠質細胞中NOS蛋白表達的影響

1.1 SBF對星形膠質細胞中eNOS蛋白表達的影響與空白組相比，模型組星形膠質細胞中棕色顆粒數量明顯減少，顏色變淺，陽性細胞數量也明顯減少，通過陽性面積比例的統計學分析，模型組細胞eNOS含量降低60.83%(P＜0.01)。與模型組相比，半枝蓮黃酮3個劑量組能不同程度提高星形膠質細胞中eNOS的蛋白含量，半枝蓮黃酮17.5、35及70 mg/L能分別提高eNOS含量73.66%、137.77% (P＜0.01)及81.67%(P＜0.05)，見圖1。

Figure 1.Effect of SBF on eNOS expression in Aβ25-35-damaged astrocytes.A:control group;B:model group;C～E:SBF groups at doses of 17.5，35 and 70 mg/L，respectively(DAB staining，×200).Mean±SD.n=6.##P＜0.01 vs control;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model.圖1 SBF對Aβ25-35損傷的星形膠質細胞中eNOS蛋白表達的影響

1.2 SBF對星形膠質細胞中iNOS蛋白表達的影響

與空白組相比，模型組星形膠質細胞中陽性細胞數量明顯增加，且細胞內棕色顆粒數量明顯增加，顏色變深，通過陽性面積比例統計學分析，模型組細胞iNOS含量增加215.03%(P＜0.01)。與模型組相比，半枝蓮黃酮3個劑量組能不同程度降低星形膠質細胞中iNOS蛋白含量，半枝蓮黃酮17.5、35及70 mg/L能分別降低iNOS含量29.36%(P＜0.01)、44.50%(P＜0.01)及19.40%(P＜0.01)，見圖2。

1.3 SBF對星形膠質細胞中nNOS蛋白表達的影響

通過nNOS免疫組化測定，發現各組細胞胞核藍染，胞漿內無陽性棕黃色顆粒，星形膠質細胞中不表達nNOS。

2 SBF對星形膠質細胞中HSP70蛋白表達的影響

與空白組相比，模型組細胞HSP70蛋白表達增加166.67%(P＜0.01)。與模型組相比，半枝蓮黃酮3個劑量組能不同程度減少星形膠質細胞中的HSP70蛋白表達，半枝蓮黃酮17.5、35及70 mg/L能分別減少HSP70蛋白的表達18.52%(P＜0.01)、49.38%(P＜0.01)及33.95%(P＜0.01)，見圖3。

Figure 2.Effect of SBF on iNOS expression in Aβ25-35-damaged astrocytes.A:control group;B:model group;C～E:SBF groups at doses of 17.5，35 and 70 mg/L，respectively(DAB staining，×200).Mean±SD.n=6.##P＜0.01 vs control;＊＊P＜0.01 vs model.圖2 SBF對Aβ25-35損傷的星形膠質細胞中iNOS蛋白表達的影響

Figure 3.Effect of SBF on HSP70 expression in Aβ25-35-damaged astrocytes.The expression of HSP70 was assayed by Western blotting.Mean±SD.n=6.##P＜0.01 vs control;＊＊P＜0.01 vs model.圖3 SBF對Aβ25-35損傷的星形膠質細胞中HSP70蛋白表達的影響

3 SBF對星形膠質細胞中apoE表達的影響

與空白組比較，模型組apoE mRNA含量增加150%(P＜0.01)。與模型組相比，半枝蓮黃酮3個劑量組能不同程度降低星形膠質細胞中apoE mRNA的含量，其中半枝蓮黃酮17.5、35及70 mg/L能分別降低apoE mRNA含量14.17%(P＜0.01)、41.67%(P＜0.01)及37.50%(P＜0.01)，見圖4。

Figure 4.Effect of SBF on apoE expression in Aβ25-35-damaged astrocytes.The expression of apoE was determined by RT-PCR.Mean ±SD.n=6.##P＜0.01 vs control;＊＊P＜0.01 vs model.圖4 SBF對Aβ25-35損傷的星形膠質細胞中apoE mRNA表達的影響

討論

AD的特征性病理改變是腦內出現Aβ聚集而形成的老年斑(senile plaques，SPs)和tau蛋白過度磷酸化而產生的NFTs，同時伴隨以海馬、皮層區域為主的神經元的大量丟失。星形膠質細胞是神經膠質細胞中數量最多的一種，除了以往認識的在神經系統中有支持營養作用外，與神經元之間還存在復雜的相互作用，也與許多神經退行性疾病有密切相關。NO/NOS在AD病程中可能具有雙重作用，低濃度(＜100 nmol/L)NO激活鳥苷酸環化酶，可促進神經元內cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化，經復雜信號網絡途徑，促進神經生長及抗凋亡，發揮神經保護作用。而高濃度(＞400 nmol/L)NO，可導致線粒體功能障礙、凋亡通路的激活等，從而介導神經毒性［10］。NOS是NO合成最關鍵的限速酶，其含量及活性的變化直接影響NO的生成，大量研究通過NOS來探討其有關作用。目前已確定的NOS有3種亞型，分別是nNOS、iNOS和eNOS。nNOS主要存在于神經元中，本實驗發現星形膠質細胞幾乎不表達nNOS或表達很少。大量激活的星形膠質細胞出現在AD早期階段的未成熟老年斑周圍，同時，這些星形膠質細胞中iNOS的表達也增加，提示iNOS持續產生過量的NO在AD的發展過程中起到促進作用［11］。本實驗模型組星形膠質細胞中iNOS表達明顯增加，eNOS表達明顯減少，半枝蓮黃酮能不同程度改善NOS蛋白表達紊亂的現象，減少NO的神經損傷。

HSP是細胞受到各種刺激時產生的具有重要生理功能和高度保守的多肽類蛋白質分子家族，參與蛋白質的合成、折疊、裝配、轉運和降解等過程，以維持細胞蛋白自穩，提高細胞對應激原的耐受性，并有助于細胞恢復正常的結構和機能。HSP70是生物中含量最多、最重要的HSP家族之一，細胞應激后生成最顯著［12］。有研究利用Aβ轉基因C.elegans線蟲模型，通過siRNA技術內源性調節HSP70的表達，發現HSP70可以減少Aβ聚集，抑制Aβ的毒性作用［13］。同時，有實驗證實了外源性HSP70能夠促進小膠質細胞吞噬和清除Aβ1-42，機制可能與外源性HSP70通過Toll樣受體4誘導NF-κB及激活p38 MAPK途徑有關，說明HSP70在促進Aβ的清除中起到重要作用［14］。本實驗發現，在Aβ的刺激損傷下星形膠質細胞中HSP70蛋白表達明顯代償性增加，來抵御Aβ的神經毒性損傷，以保護細胞。半枝蓮黃酮干預后，細胞得到一定程度的保護，HSP70蛋白的表達開始出現不同程度的下調，間接說明了半枝蓮黃酮對于Aβ損傷星形膠質細胞有一定保護作用。

ApoE主要在肝臟和大腦中合成，在中樞神經系統主要是星形膠質細胞產生，而在周圍神經系統是通過巨噬細胞合成。Aβ是老年斑的核心成分，其毒性作用使神經突起變性，導致神經元損傷。當中樞神經系統損傷時，星形膠質細胞合成apoE增加，并向受損部位運送增加，apoE與Aβ結合，形成apoEAβ復合物由中性粒細胞通過LRP介導清除［15］。ApoE-Aβ復合物是AD腦中淀粉樣沉淀的主要成分，在AD病人中，apoEε4純合個體表現出更大的細胞外淀粉樣斑塊和密度［16］。進一步研究顯示，apoE在體外實驗中可以促進可溶性Aβ向淀粉樣纖維的β-折疊片層構造的轉化，由此可以得到apoE參與Aβ聚合和老年斑形成的假說［17］。ApoE在神經元損傷后的修復過程中起到重要作用，在對腦組織損傷的反應中，apoE mRNA的水平升高，神經元膽固醇合成降低，與細胞結合的脂蛋白增多［18］，這些改變都說明apoE通過重復利用受損細胞的膜成分進而幫助細胞修復。本實驗發現，與空白組相比，模型組星形膠質細胞apoE mRNA含量明顯增加，說明在Aβ損傷情況下，細胞合成apoE增加，半枝蓮黃酮能不同程度減少apoE mRNA，對于改善Aβ損傷星形膠質細胞有明顯作用。

半枝蓮含有多種化學成分，以黃酮類化合物為主，其中以野黃芩苷含量最多，研究發現，半枝蓮及其提取成分具有抗腫瘤、抗衰老和抗氧化等功效［19］，但除了黃酮類成分，還含有生物堿、酚類和鞣質等，本研究部分實驗結果中，某些被檢指標中劑量作用出現降低，量效曲線呈倒U形，這一結果符合中藥藥效學常見的實驗結果。綜上所述，本實驗發現半枝蓮黃酮在一定濃度范圍內對Aβ25-35引起的損傷具有保護作用;通過藥物對星形膠質細胞的干預成為對AD治療的新靶點。

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Effects of Scutellaria barbata flavonoids on abnormal expression of NOS，HSP70 and apoE induced by Aβ25-35in rat astrocytes

FAN Yue，WU Xiao-guang，ZHAO Hong-xiang，SHANG Ya-zhen
(Hebei Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Research and Development，Institute of Traditional Chinese Medicine，Chengde Medical College，Chengde 067000，China.E-mail:shangyz1018@sina.com)

AIM:To study the effects of Scutellaria barbata flavonoids(SBF)on abnormal expression of nitric oxide synthase(NOS)，heat-shock protein 70(HSP70)and apolipoprotein E(apoE)induced by Aβ25-35in rat astrocytes.METHODS:The third generation of cultured rat astrocytes was divided into 5 groups.The cells in 3 drug treatment groups were given SBF at dose of 17.5 mg/L，35 mg/L and 70 mg/L for 24 h，and then the cells in model group and 3 doses of SBF groups were exposed to Aβ25-35at concentration of 100 μmol/L for 24 h.The expression of endothelial nitric oxide synthase(eNOS)，inducible nitric oxide synthase(iNOS)and neuronal nitric oxide synthase(nNOS)in the cultured cells was assayed by immunohistochemical method.The expression of HSP70 was estimated by Western blotting and the mRNA expression of apoE was assessed by RT-PCR.RESULTS:Compared with control group，the protein level of eNOS were significantly decreased and the protein level of iNOS increased(P＜0.01)in model group.The protein expression of HSP70 and mRNA expression of apoE were notably increased(P＜0.01)in model group.However，these disturbances were attenuated by SBF at dose of 17.5，35 and 70 mg/L(P＜0.01).CONCLUSION:SBF has an obvious protective effect on damaged astrocytes induced by Aβ25-35，suggesting that SBF may be helpful for the treatment of Alzheimer disease.

Alzheimer disease;Astrocytes;Scutellaria barbata flavonoids;Nitric oxide synthase;Heat-shock protein 70;Apolipoproteins E

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.031

1000-4718(2014)02-0359-06

2013-07-05

2013-12-04

河北省自然科學基金資助項目(No.C2009001007);河北省中醫藥管理局資助項目(No.05027)

△通訊作者Tel:0314-2290616;E-mail:shangyz1018@sina.com