趨化因子CXCL14在結直腸癌組織中的表達及其臨床相關性研究*

林刻智，林峰，鄭雙，沈潔△，沈賢，薛向陽

(1溫州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學實驗中心，浙江溫州 325035;2臺州市第一人民醫(yī)院普外科，浙江臺州 318020;3溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胃腸外科，浙江溫州 325000;4溫州醫(yī)科大學微生物與免疫學教研室，分子病毒與免疫研究所，浙江溫州 325035)

趨化因子CXCL14在結直腸癌組織中的表達及其臨床相關性研究*

林刻智1，林峰2，鄭雙2，沈潔2△，沈賢3，薛向陽4△

(1溫州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學實驗中心，浙江溫州 325035;2臺州市第一人民醫(yī)院普外科，浙江臺州 318020;3溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胃腸外科，浙江溫州 325000;4溫州醫(yī)科大學微生物與免疫學教研室，分子病毒與免疫研究所，浙江溫州 325035)

目的:分析趨化因子CXCL14在結直腸癌組織中的表達，并探討其表達的臨床意義。方法：采用實時熒光定量PCR和免疫組化對40例結直腸癌及癌旁正常組織CXCL14的表達進行檢測。Kaplan-Meier生存曲線和Cox回歸模型評估CXCL14在結直腸癌組織中表達的臨床意義。結果:CXCL14 mRNA和蛋白水平在結直腸癌組織中的表達較正常組織明顯降低(P＜0.05)。臨床相關性分析表明，CXCL14表達的下調與腫瘤淋巴結轉移、發(fā)生部位以及臨床病理分期有關(P＜0.05)。Kaplan-Meier生存分析顯示，不同CXCL14蛋白表達水平的患者，生存時間具有顯著差異(P＜0.01)。結論:CXCL14可能參與結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程。

趨化因子CXCL14;生存分析;結直腸腫瘤

結直腸癌是胃腸道最常見的惡性腫瘤之一，每年全球約有40萬病例死于該病［1］。迄今，結直腸癌發(fā)生和發(fā)展的機制仍不清楚。腫瘤微環(huán)境已逐漸被認為是癌癥發(fā)生和發(fā)展的一個重要的參與者［2-4］，其中的趨化因子在腫瘤增殖、轉移等方面起著重要作用［3-4］。趨化因子CXCL14是CXC趨化因子家族的一員。研究發(fā)現，CXCL14在不同類型腫瘤表達不一致，在腎癌、肺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、宮頸癌等組織中幾乎沒有表達或者表達很低［5-8］，而在部分前列腺癌和胰腺癌中［9-10］卻高水平表達。我們前期胃癌標本檢測結果也發(fā)現CXCL14表達在腫瘤組織明顯降低［11］。迄今，CXCL14在結直腸癌中的表達及臨床意義目前仍不清楚。因此，本研究分析CXCL14在結直腸癌組織中蛋白和mRNA的表達及臨床意義。

材料和方法

1 材料

2 方法

2.1 組織標本采集及處理本研究的結直腸癌40例患者來自2008年12月至2009年4月臺州市第一人民醫(yī)院內鏡活檢確診并經外科治療的病人。結直腸癌的組織病理學診斷由醫(yī)院病理科根據世界衛(wèi)生組織的標準，術后證實。所有這些患者術前未接受放療或化療，術后根據美國國立癌癥綜合網(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)結直腸癌指南接受嚴格的化療。以上結直腸癌組織及相應正常組織(取自距腫瘤邊緣2 cm處)的成對標本(經病理確診)均被分為2部分:一部分樣本在手術切除后30 min，采用液氮冷凍保存，以備RNA的提取;其余組織由4%甲醛固定，石蠟包埋、切片，進行免疫組化檢測。

2.2 RNA的分離純化總RNA的提取參照Trizol試劑說明書進行。為去除可能污染的DNA，抽提的RNA經DNaseⅠ處理后，酚-氯仿抽提，純化的RNA 以DEPC水溶解，用紫外分光光度計檢測RNA濃度后，-80℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 CXCL14 mRNA檢測參照ReverTra Ace逆轉錄試劑盒說明書，取1 μL提取的RNA以Oligo dT進行逆轉錄。反應條件為:42℃60 min，75℃15 min，反應結束后-20℃保存。以15 μL反應體系進行real-time PCR。相關分析的引物序列見表1。反應體系包括:1 μL逆轉錄產物，1×SYBR Green I Master Mix，0.5 μmol/L特異前向引物，0.5 μmol/L特異反向引物。反應條件為:95℃2 min后，95℃15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)。使用Bio-Rad CFX96儀器進行。所有樣品做3復孔。根據待測標本的Ct值，以GAPDH為內參照，采用相對定量法，以2-ΔΔCt表示標本中CXCL14相對表達量，其中ΔΔCt=(CtCXCL14-CtGAPDH)腫瘤-(CtCXCL14-CtGAPDH)正常。

表1 引物序列Table 1.Primer sequences

2.4 免疫組化檢測甲醛固定和石蠟包埋結直腸癌組織塊樣本切片，厚4 μm，玻片經0.1%多聚賴氨酸處理;二甲苯脫蠟至蒸餾水。用0.3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶10 min，PBS洗滌3次;檸檬酸鹽緩沖液進行高壓修復1.5 min。自然冷卻至室溫后，PBS(0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.4)洗滌3 次;羊血清封閉2 h;加入Ⅰ抗，4℃過夜。加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔Ⅱ抗37℃，孵育30 min; DAB顯色。蘇木素復染、分化、透明，中性樹膠封片。設陰性對照組以0.01 mol/L PBS代替Ⅰ抗。結果判定:CXCL14定位于胞漿，胞漿顯色呈棕色為陽性表達;用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件計算平均吸光度值，并進行統(tǒng)計分析。

3 統(tǒng)計學處理

用統(tǒng)計軟件SPSS 19分析。數據以均數±標準差(mean±SD)表示。配對樣本間比較采用Wilcoxon符號秩檢驗，兩組獨立樣本間比較采用Mann-Whitney U檢驗，3組及以上獨立樣本間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗;采用Kaplan-Meier生存曲線分析CXCL14蛋白表達與預后的關系。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 結直腸癌組織CXCL14 mRNA的表達

如圖1A所示，CXCL14和GAPDH的熔解曲線為單峰，表明我們建立的實時熒光定量PCR方法能特異擴增目的基因。采用上述實時熒光定量PCR方法，我們進一步分析結直腸癌組織CXCL14 mRNA的表達。如圖1B所示，腫瘤樣本CXCL14 mRNA的相對表達值明顯低于配對的正常組織(P＜0.01)。

為了能夠有效地測量企業(yè)員工的組織承諾，提高員工對組織的忠誠感與歸屬感，各國學者編制了各種不同的組織承諾量表，比較典型的有以下幾種：

Figure 1.Expression of CXCL14 mRNA in colorectal cancer tissues.A:melting curves;B:relative mRNA expression of CXCL14.Mean±SD.n=20.＊＊P＜0.01 vs normal.圖1 結直腸癌組織CXCL14 mRNA的表達

2結直腸癌組織CXCL14蛋白表達的免疫組化分析

結直腸癌組織與其配對正常組織CXCL14蛋白水平的表達見圖2。CXCL14蛋白表達在胞漿，正常組織CXCL14表達呈強陽性、棕色染色，而腫瘤組織表達低或幾乎無表達。采用半定量分析免疫組化結果，腫瘤樣本及正常CXCL14的平均吸光度值分別為0.5411和0.1769。統(tǒng)計分析顯示，CXCL14在腫瘤樣品的表達水平低于正常組織(P＜0.01)。

3 CXCL14蛋白表達水平與結直腸癌臨床病理特征相關性

進一步分析腫瘤組織CXCL14的表達與結直腸癌臨床病理特征相關性顯示，CXCL14蛋白的表達與腫瘤的發(fā)生部位、淋巴結轉移以及臨床病理分期有顯著相關性(P＜0.05)。有淋巴結轉移的結直腸癌腫瘤組織CXCL14的相對表達量明顯低于無淋巴結轉移腫瘤組織(P＜0.05)。病理分期屬III、IV期的結直腸癌腫瘤組織CXCL14的相對表達量也明顯低于病理分期屬I、II期的標本(P＜0.05)。CXCL14的表達與年齡、性別、浸潤程度、腫瘤標志物等未見顯著相關性(P＞0.05)，見表2。

4 腫瘤組織CXCL14表達水平與結直腸癌預后分析

Figure 2.Expression of CXCL14 protein in colorectal cancer tissues(immunohistochemical staining，×200).A:normal;B1～4:tumorⅠ～Ⅳ，respectively.Mean± SD.n=20.＊＊P＜0.01 vs normal.圖2 結直腸癌組織CXCL14蛋白的表達

表2 結直腸癌標本CXCL14蛋白表達與臨床病理特征的相關性分析Table 2.Correlation between clinicopathological features and CXCL14 protein expression in 40 specimens

40例結直腸癌標本總生存率為50.0%，根據成對腫瘤與正常組織CXCL14蛋白表達平均吸光度的相對值，設≥1/3的為1組，＜1/3為2組，分別為22 和18例。Kaplan-Meier生存分析顯示，1組和2組5年生存率分別為72.7%和11.1%，差異顯著(P＜0.01)，見圖3。

Figure 3.Survival curves of the colorectal cancer patients with different expression levels of CXCL14.1:high expression group:average absorbance value(tumor vs normal)≥1/3;2:low expression group:average absorbance value(tumor vs normal)＜1/3.圖3 直結腸癌患者不同CXCL14相對表達水平的生存曲線

討論

腫瘤微環(huán)境的研究是目前腫瘤相關研究的熱點。腫瘤微環(huán)境的細胞能分泌一些趨化因子，調節(jié)血管生成、宿主特異性免疫激活以及腫瘤細胞生長等腫瘤細胞和間質細胞間基本的生物學過程［2-4］。CXCL14是一種新型的趨化因子成員，最初是由Hromas等［12］報道。它的基因位于染色體5p31.1，由77個氨基酸組成［5］。除淋巴組織外，CXCL14在大腦、小腸、腎和上皮細胞等都有表達［6］。炎癥反應時，CXCL14往往傾向于降低［13］。已經證實，CXCL14可以抗血管生成，還有趨化自然殺傷細胞、B細胞、巨噬細胞、單核細胞、未成熟樹突狀細胞等多種功能［2，6，13-15］。除了免疫學方面的功能，作為一個多功能趨化因子的CXCL14還與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關。研究顯示，CXCL14在乳腺癌、腎細胞癌、肺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、宮頸癌及胃癌組織中的表達減少或缺失［6-8，11-12，16］。Gu等［17］還發(fā)現在乳腺癌的生長和轉移中，CXCL14蛋白的表達與淋巴結轉移具有負相關性。

為分析CXCL14表達與結直腸癌的相關性，本研究通過實時熒光定量PCR和免疫組化檢測結直腸癌腫瘤組織和癌旁正常組織CXCL14 mRNA及蛋白表達水平。與絕大多數腫瘤相關研究報道一致［6-8，11-12，16］，我們發(fā)現CXCL14在結直腸癌組織中的表達明顯低于正常組織。但本研究結果與最近Zeng等［18］的結果相反。為排除實驗的誤差，我們嚴格按照該文獻提供的試劑和方法平行進行免疫組化檢測，結果仍是結直腸癌組織標本CXCL14表達降低。

進一步分析CXCL14蛋白表達與臨床病理特征的相關性發(fā)現，有淋巴結轉移的結直腸癌腫瘤組織CXCL14表達明顯低于無淋巴結轉移腫瘤組織;病理分期屬III、IV期的結直腸癌腫瘤組織CXCL14的相對表達量也明顯低于病理分期屬I、II期的標本。此外，腫瘤組織CXCL14表達水平與結直腸癌預后明顯相關。這些現象提示，CXCL14參與結直腸癌的發(fā)展。已經證實，CXCL14可以通過抑制血管平滑肌細胞的趨化和微血管系統(tǒng)抑制腫瘤血管的形成［2，5，19-20］。這提示CXCL14不但是結直腸癌預后判斷的重要指標，而且是一個新的候選治療靶點。CXCL14表達水平與腫瘤浸潤深度、性別、年齡、大小、分化等未見明顯相關性，但直腸癌腫瘤組織CXCL14表達明顯低于結腸癌組織，可能是不同組織CXCL14的基礎表達水平不同。

綜上所述，結直腸腫瘤組織中CXCL14表達減少可能參與了結直腸癌的發(fā)生和發(fā)展進程。檢測腫瘤組織CXCL14的表達水平可作為結直腸癌患者預后評價的的臨床輔助指標。

［1］Steele GD Jr，Jessup LM，Winchester DP，et al.Clinical highlights from the National Cancer Data Base:1995［J］.CA Cancer J Clin，1995，45(2):102-111.

［2］Shellenberger TD，Wang M，Gujrati M，et al.BRAK/ CXCL14 is a potent inhibitor of angiogenesis and a chemotactic factor for immature dendritic cells［J］.Cancer Res，2004，64(22):8262-8270.

［3］Balkwill F.The significance of cancer cell expression of the chemokine receptor CXCR4［J］.Semin Cancer Biol，2004，14(3):171-179.

［4］Zlotnik A，Burkhardt AM，Homey B.Homeostatic chemokine receptors and organ-specific metastasis［J］.Nat Rev Immunol，2011，11(9):597-606.

［5］Hara T，Nakayama Y.CXCL14 and insulin action［J］.Vitam Horm，2009，80:107-123.

［6］Sleeman MA，Fraser JK，Murison JG，et al.B cell-and monocyte-activating chemokine(BMAC)，a novel non-ELR alpha-chemokine［J］.Int Immunol，2000，12(5): 677-689.

［7］Tessema M，Klinge DM，Yingling CM，et al.Re-expression of CXCL14，a common target for epigenetic silencing in lung cancer，induces tumor necrosis［J］.Oncogene，2010，29(37):5159-5170.

［8］Balkwill FR.The chemokine system and cancer［J］.J Pathol，2012，226(2):148-157.

［9］Augsten M，H?ggl?f C，Olsson E，et al.CXCL14 is an autocrine growth factor for fibroblasts and acts as a multi-modal stimulator of prostate tumor growth［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106(9):3414-3419.

［10］Wente MN，Mayer C，Gaida MM，et al.CXCL14 expression and potential function in pancreatic cancer［J］.Cancer Lett，2008，259(2):209-217.

［11］Hu C，Lin F，Zhu G，et al.Abnormal hypermethylation of promoter region downregulates chemokine CXC ligand 14 expression in gastric cancer［J］.Int J Oncol，2013，43 (5):1487-1494.

［12］Hromas R，Broxmeyer HE，Kim C，et al.Cloning of BRAK，a novel divergent CXC chemokine preferentially expressed in normal versus malignant cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，1999，255(3):703-706.

［13］Kurth I，Willimann K，Schaerli P，et al.Monocyte selectivity and tissue localization suggests a role for breast and kidney-expressed chemokine(BRAK)in macrophage development［J］.J Exp Med，2001，194(6):855-861.

［14］Starnes T，Rasila KK，Robertson MJ，et al.The chemokine CXCL14(BRAK)stimulates activated NK cell migration:implications for the downregulation of CXCL14 in malignancy［J］.Exp Hematol，2006，34(8):1101-1105.

［15］Juremalm M，Nilsson G.Chemokine receptor expression by mast cells［J］.Chem Immunol Allergy，2005，87:130-144.

［16］Park CR，You DJ，Kim DK，et al.CXCL14 enhances proliferation and migration of NCI-H460 human lung cancer cells overexpressing the glycoproteins containing heparan sulfate or sialic acid［J］.J Cell Biochem，2013，114(5): 1084-1096.

［17］Gu XL，Ou ZL，Lin FJ，et al.Expression of CXCL14 and its anticancer role in breast cancer［J］.Breast Cancer Res Treat，2012，135(3):725-735.

［18］Zeng J，Yang X，Cheng L，et al.Chemokine CXCL14 is associated with prognosis in patients with colorectal carcinoma after curative resection［J］.J Transl Med，2013，11:6.

［19］Maerki C，Meuter S，Liebi M，et al.Potent and broadspectrum antimicrobial activity of CXCL14 suggests an immediate role in skin infections［J］.J Immunol，2009，182 (1):507-514.

［20］張琦，陳融，牛軍.αvβ6整合素對氟尿嘧啶誘導的結腸癌細胞凋亡的影響［J］.中國病理生理雜志，2009，25(2):231-235.

Down-regulation of chemokine CXCL14 and its clinical relevance in colorectal cancer

LIN Ke-zhi1，LIN Feng2，ZHENG Shuang2，SHEN Jie2，SHEN Xian3，XUE Xiang-yang4
(1Medical Experimental Teaching Center，Wenzhou Medical University，Wenzhou 325035，China;2Department of General Surgery，Taizhou First People’s Hospital，Taizhou 318020，China;3Department of Gastrointestinal Surgery，The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China;4Department of Microbiology and Immunology，Institute of Molecular Virology and Immunology，Wenzhou Medical University，Wenzhou 325035，China.E-mail:linfeng0316 @aliyun.com;wzxxy001@163.com)

AIM:To investigate the expression of chemokine CXCL14 and its clinical significance in colorectal cancer.METHODS:The CXCL14 expression was detected by real-time PCR and immunohistochemistry.Kaplan-Meier curve and Cox regression were used to evaluate the clinical significance of CXCL14 in colorectal cancer.RESULTS:The expression of CXCL14 at mRNA and protein levels declined in colorectal cancer tissues compared with the paired normal tissues(P＜0.05).Down-regulation of CXCL14 was associated with tumor lymph node metastasis，the site and the clinical pathological stage(P＜0.05)，and also correlated with the prognosis closely.Kaplan-Meier survival analysis showed that the protein expression levels of CXCL14 were significantly different in the patients with different survival time(P＜0.01).CONCLUSION:It is possible that CXCL14 acts a role in the development and progression of colorectal cancer.

Chemokine CXCL14;Survival analysis;Colorectal neoplasms

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.030

1000-4718(2014)02-0355-05

2013-09-22

2013-12-27

浙江省科技廳公益性技術應用研究計劃項目(No.2012C37080);浙江省教育廳項目(No.Y201327980)

△通訊作者Tel:0577-86689910;沈潔E-mail:linfeng0316@aliyun.com;薛向陽E-mail:wzxxy001@163.com