siRNA沉默MAG促進腦出血后大鼠運動功能的改善*

劉安民，羅銘，蔡望青，陳舒，何明亮，潘偉生

(中山大學孫逸仙紀念醫院1神經外科，2腫瘤科，廣東廣州 510120;3香港中文大學，中國香港)

siRNA沉默MAG促進腦出血后大鼠運動功能的改善*

劉安民1△，羅銘2，蔡望青1，陳舒1，何明亮1，潘偉生3

(中山大學孫逸仙紀念醫院1神經外科，2腫瘤科，廣東廣州 510120;3香港中文大學，中國香港)

目的:研究慢病毒介導的siRNA沉默髓鞘相關糖蛋白(MAG)對腦出血后脫髓鞘再生和神經功能恢復的影響。方法：SD大鼠45只，隨機分為3組:模型+siRNA組、模型+PBS組和正常對照組，每組15只。膠原酶誘導建立腦出血模型，據不同組別于模型術后1 d立體定向下進行側腦室注射攜帶MAG基因siRNA的慢病毒和PBS。分別于治療前1 d和治療后1、7、14、21 d用Rotarod運功功能評分檢測大鼠神經功能情況，應用勞克堅牢藍(luxol fast blue)檢測腦損傷區的神經纖維恢復情況，利用免疫組化和Western blotting檢測MAG的表達變化。結果:Rotarod評分檢測腦出血模型大鼠術后的運動功能，模型+siRNA組的神經功能改善和神經纖維修復較模型+ PBS組明顯提高(P＜0.05)，勞克堅牢藍染色示siRNA組較PBS組的神經纖維損害范圍縮小，siRNA組的MAG蛋白的表達較PBS組明顯下降(P＜0.05)。結論:siRNA沉默MAG后明顯提高神經纖維髓鞘再生能力，促進腦出血后神經功能缺失的修復。

髓鞘相關糖蛋白;RNA干擾;髓鞘再生;腦出血;大鼠

自發性腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是一種臨床常見病，其發病率、死亡率很高，即使生存者也往往留下明顯的神經功能障礙，但至今對其病理損傷機制尚不完全明確［1］。我們的前期研究發現，髓鞘相關糖蛋白(myelin-associated glycoprotein，MAG)是維持中樞神經系統神經纖維髓鞘結構和功能穩定的重要結構，ICH后MAG蛋白的表達顯著升高，MAG是抑制ICH后髓鞘再生的重要原因之一［2-3］。許多研究證實，髓鞘的相關抑制因子(如MAG等)是神經再生的關鍵性抑制因素［4-5］。在近期的研究中，我們采用RNA干擾技術，構建重組慢病毒載體，篩選鑒定出的shRNA能高效、特異性沉默MAG的表達［6］。本研究將把已經鑒定的、穩定表達MAG siRNA的慢病毒載體利用腦定向注入ICH模型的側腦室內，探討沉默MAG對ICH后腦損傷髓鞘再生的作用。

材料和方法

1 主要材料

SD大鼠(中山大學實驗動物中心提供)，膠原酶Ⅳ型(Sigma)，鼠抗人MAG單克隆抗體和鼠抗actin多克隆抗體為Santa Cruz產品。立體定位儀為David Kopf Instruments產品，微型顱鉆為NSK Volvere GX產品，上海安亭微量進樣器廠微量進樣器，Rotarod motor test測試儀由中山大學藥學院提供，Bio-Rad電泳儀，OKAMOTO X3自動X線顯影儀，Bio-Rad Model GS-670灰度分析掃描儀，Canon照相機和Zeiss顯微鏡成像系統。

2 動物和分組

健康雄性SD大鼠45只，體重220～230 g，鼠齡10周。實驗隨機分為模型+siRNA組、模型+PBS組和正常對照組，每組15只。

3 模型制作

內囊腦出血動物模型定位［7］:腹腔注射麻醉后，俯臥位將大鼠頭部固定在立體定位儀上，保持前囟和后囟在同一水平。于顱正中線上切開皮膚約1.5 cm，據定位用顱鉆鉆一直徑約1 mm的骨孔，通過立體定位儀定位，利用微量進樣器將0.21 CDU/1.5 μL膠原酶Ⅳ型緩慢推進腦內，注射時間維持5 min，注射完后將針停留5 min后緩慢退針，再用骨蠟封閉骨孔、縫合頭皮。

4 重組慢病毒MAG基因siRNA的制備

我們成功完成了運用慢病毒載體系統進行重組慢病毒MAG siRNA的制備，并證實慢病毒介導的shRNA干擾技術可特異性沉默MAG的表達，見參考文獻［6］。

5 側腦室注射方法

大鼠左側腦室模型定位［2-3］，顱骨背側中線左旁1.3 cm，前囟前0.8 cm，深度為腦表面下3.7 cm。操作步驟:操作步驟基本同模型制作，通過立體定位儀定位，利用微量進樣器據不同組別將6 μL慢病毒MAG基因siRNA(1×1011cfu/L)和6 μL PBS緩慢推進ICH模型大鼠的左側腦室內，注射時間維持5 min，注射完后將針停留5 min后緩慢退針。

6 大鼠行為學檢測

大鼠行為學檢測:運用Rotarod運動功能測試評分［2，7］。前3 d開始進行Rotarod功能訓練，大鼠放在加速、旋轉的圓柱體上(5 min內4～40 r/min)，記錄大鼠在Rotarod上停留的時間。以大鼠從柱上掉下、抱住圓柱、旋轉2圈或以上為測試結束。分別記錄術前1 d和治療后1、7、14、21 d大鼠在Rotarod柱上的持續時間。每個時點測試3次，取最長的持續時間(以秒計算)為每次測試時間。將術后測試時間與術前最長測定時間相比的百分率作為比較參數。

7 標本處理、組織學染色和蛋白定量分析

于術后第21 d行為學實驗后處死大鼠，腦組織按常規處理，石蠟包埋固定，做層厚5 μm切片，進行勞克堅牢藍(Luxol fast blue)染色觀察神經纖維情況和免疫組化染色觀察MAG。常規取腦組織，Western bloting測定MAG蛋白含量。

8 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，運用SPSS 13.0統計軟件，均數比較采用t檢驗或單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 實驗動物數量分析

所有動物術后均存活，無一傷口感染、死亡等。術后腦出血模型大鼠均出現肢體偏癱癥狀，再次手術進行治療后大鼠均存活，無一死亡例數。所有45只大鼠均進入結果分析。

2 siRNA干預對ICH大鼠運動功能的影響

模型+PBS組和模型+siRNA組大鼠治療后1、7 d的Rotarod評分無顯著差異(P＞0.05)。治療后14 d，模型+siRNA組的Rotarod持續時間較模型+ PBS組明顯延長(P＜0.05)，此種差異一直延續到治療后21 d，見圖1。

Figure 1.Results of Rotarod motor test.Model+siRNA group showed better performance from 14 d and these benefits continuned up to the 21st day.Mean±SD.n= 6.*P＜0.05 vs model+PBS group.圖1 大鼠Rotarod運動功能評分比較

3 siRNA治療對有髓神經纖維的修復

術后21 d的腦組織切片勞克堅牢藍染色結果顯示，有髓纖維呈鮮藍色，神經細胞胞體及尼氏體呈微紫色。正常組腦內有髓纖維正常分布，模型+PBS組血腫周圍組織僅有少量藍染的有髓神經纖維，模型+siRNA組可見較多的藍染有髓神經纖維;在血腫周圍組織，模型+siRNA組較模型+PBS組的神經纖維損害范圍縮小，見圖2。

Figure 2.Representative images of Luxol fast blue staining of myelin in coronal sections of the ipsilateral internal capsule with intracerebral hemorrhage(ICH)on the 21st day(×50).A:normal rat;B:remarkable demyelination in ICH rat with intracerebroventricular injection of PBS;C:significant remyelination in ICH rat treated with lentiviral-siRNA of MAG gene.圖2 術后21 d腦組織勞克堅牢藍染色結果

4 siRNA治療對腦組織MAG蛋白表達的影響

免疫組織化學染色顯示，MAG主要位于胼胝體和白質神經細胞的細胞漿內;模型+siRNA組血腫周圍組織的MAG表達較模型+PBS組明顯下降，見圖3。經Western blotting定量分析可見，與模型+ PBS組比較，模型+siRNA組MAG的含量明顯降低(P＜0.05)，見圖4。

討論

腦出血是指原發的非外傷性的腦實質內出血，其急性期病死率高，即使幸存，也約有75%不同程度喪失勞動能力，重度致殘者占40%以上，給社會和家庭帶來了巨大的負擔。由于對ICH的發病機制尚未完全闡明，目前臨床實踐中還無特別有效的治療方法。近來研究發現，ICH后可引起血腫周圍髓鞘和軸索損傷，與維持神經纖維髓鞘結構和功能穩定的MAG等出現明顯的改變;由此導致的脫髓鞘損傷是ICH后神經功能缺損的重要原因［2-3，8］。

MAG是一種跨膜糖蛋白，參與髓鞘化的啟動及髓鞘化軸突與膠質突起之間穩定連接的維持［9］。研究還發現，MAG在中樞神經系統中有維持髓鞘的完整性和抑制中樞神經系統軸突再生的作用［4-5］;研究表明，通過免疫耗竭法除去MAG后，可明顯減少髓鞘對軸突生長的抑制作用［9］。在合適的微環境下可以利于髓鞘的再生，即可以通過抑制阻礙再生和增強促進再生的因素來促進神經的再生能力［10］。RNA干擾技術是由雙鏈RNA介導的，在轉錄后mRNA水平關閉相應基因表達的過程，siRNA具有普遍性、高效性、特異性和記憶性，具有簡單、快速關閉特定基因功能的優點［11-12］。本研究通過免疫組化和蛋白定量測定發現，重組慢病毒介導的MAG siRNA治療腦出血后能顯著降低腦組織中MAG蛋白的表達，基因沉默效果明顯。這為深入研究MAG在髓鞘損傷的發病機制奠定基礎。

Figure 3.Representative images of immunohistochemical staining of myelin-associated glycoprotein(MAG;dark brown) in coronal sections of the ipsilateral internal capsule with intracerebral hemorrhage(ICH)on the 21st day (×100).A:normal rat;B:remarkable demyelination in ICH rat with intracerebroventricular injection of PBS;C:significant remyelination in ICH rat treated with lentiviral-siRNA of MAG gene.圖3 術后21 d血腫周圍組織MAG的免疫組化結果

Figure 4.Western blotting for myelin-associated glycoprotein (MAG)extracted from the ipsilateral cerebral tissues of rats on the 21st day.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs model+PBS group.圖4 Western blotting檢測術后21 d血腫周圍組織MAG蛋白的表達

研究證實，中樞神經系統髓鞘磷脂中存在MAG軸突生長抑制性蛋白，它的抑制作用一方面與神經節苷脂GD1a和GT1b結合，形成軸索結構，維持軸索的穩定性;另一方面它與Nogo receptor 1(NgR1)/ Nogo receptor 2(NgR2)受體結合，通過RhoA途徑，向胞內傳遞抑制信號，明顯抑制突起的生長和生長錐的塌陷，抑制包括少突膠質細胞在內的軸突的生長［13］。本研究通過前期的量效關系預實驗發現，采用1×1011cfu/L的慢病毒MAG基因siRNA為最佳干擾劑量。因此，本研究采用該劑量siRNA能有效沉默MAG的表達，而且沉默MAG的表達后神經纖維的修復較對照組明顯好轉，表現在行為學上大鼠的運動功能得到顯著改善。因此，本研究認為，siRNA沉默MAG后能逆轉MAG抑制髓鞘再生的作用，從而有助于神經纖維髓鞘再生，達到改善神經缺失的目的。

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Therapeutic effect of MAG gene silencing by siRNA on remyelination and motor recovery after intracerebral hemorrhage in rats

LIU An-min1，LUO Ming2，CAI Wang-qing1，CHEN Shu1，HE Ming-liang1，PAN Weisheng3
(1Department of Neurosurgery，2Department of Oncology，Sun Yat-sen Memorial Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510120，China;3Chinese University of Hongkong，Hongkong，China.E-mail:drliuam@aliyun.com)

AIM:To study the functional rehabilitative effects of lentiviral vector-mediated siRNA silencing myelin-associated glycoprotein(MAG)on neurological improvement and remyelination after intracerebral hemorrhage (ICH)in rats.METHODS:ICH was induced in 45 adult male Sprague-Dawley rats by a stereotactically guided injection of bacterial type IV collagenase into the right internal capsule.Lentiviral vector-mediated siRNA targeting MAG(siRNA)，or PBS was administered left intracerebroventricularly 1 d after right internal capsule ICH.The Rotarod motor test scores were determined 1 d before and 1 d，7 d，14 d and 21 d after treatment.Luxol fast blue staining，immunohistological staining and Western blotting were used to detect the changes of MAG.RESULTS:Compared with PBS group，the changes of Rotarod motor test scores indicated that the ICH rats receiving siRNA had significant functional recoveries.As indicated by Luxol fast blue staining，the area of demyelination in percentage was obviously reduced in siRNA treatment group as compared with PBS group after ICH(P＜0.05).The expression of MAG detected by immunohistological staining and Western blotting was significantly lower in siRNA-treated brain than that in PBS group(P＜0.05).CONCLUSION:siRNA targeting MAG contributes to the remarkable functional recovery after ICH.The treatment promotes nerve fiber remyelination by down-regulation of the MAG expression after ICH in rats.

Myelin-associated glycoprotein;RNA inference;Remyelination;Intracerebral hemorrhage;Rats

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.014

1000-4718(2014)02-0274-04

2013-09-23

2013-12-04

廣東省自然科學基金資助項目(No.S2011010002638);廣東省科技社會發展項目(No.2012B031800356)

△通訊作者Tel:020-81332016;E-mail:drliuam@aliyun.com