甘氨雙唑鈉協同順鉑有效促進肺腺癌細胞中p21表達*

廖小方，趙中洪，郭紹文，彭政，朱小平，王燕，鄒燕，胡偉

(1浙江省中醫藥大學附屬衢州中心醫院放療科，浙江衢州 324000;2上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海 200130)

甘氨雙唑鈉協同順鉑有效促進肺腺癌細胞中p21表達*

廖小方1△，趙中洪1，郭紹文2，彭政1，朱小平1，王燕1，鄒燕1，胡偉1

(1浙江省中醫藥大學附屬衢州中心醫院放療科，浙江衢州 324000;2上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海 200130)

目的:探討甘氨雙唑鈉(CMNa)協同順鉑對肺腺癌細胞中p21表達的影響及其分子機制。方法：使用NCBI公共數據庫分析順鉑對人肺腺癌細胞作用的mRNA芯片數據，尋找差異基因;對人肺腺癌A549細胞系用CMNa和順鉑處理，用real-time PCR技術驗證A549細胞系差異基因的表達;用RT-PCR及染色質免疫沉淀技術進一步檢測CMNa對p21及其上游分子p53表達的影響。結果:通過參考公共數據庫中順鉑處理A549細胞系的mRNA芯片數據，對若干差異表達基因進行實驗驗證，發現p21受順鉑影響最為顯著;CMNa聯合順鉑處理可以有效促進A549細胞系p21的表達，但對A549細胞系單純進行CMNa處理，p21無明顯變化。此外，通過染色質免疫沉淀檢測發現，CMNa聯合順鉑處理可增加上游分子p53的表達，從而引起p21的上調。結論:CMNa可以協同順鉑上調p53表達，從而促進人肺腺癌細胞p21的表達，這提示CMNa對肺腺癌細胞的放療增敏作用可能還有新的作用機制。

甘氨雙唑鈉;順鉑;肺腫廇;p21蛋白;p53蛋白

肺腺癌屬于非小細胞性肺癌(non-small cell lung carcinoma，NSCLC)，Ⅲ期非小細胞性肺癌治療效果至今尚不理想，單純放療5年生存率只有5%左右，單純化療5年生存率只有0～3%，腫瘤中心存在乏氧細胞對放射抗拒是治療失敗的主要原因之一，因此尋找更好的放療增敏劑是常見的策略。目前臨床上主要使用的放射增敏劑之一是硝基咪唑類藥物，其中由我國自主研發的甘氨雙唑鈉(sodium glycididazole，CMNa)已經證實對肺癌、鼻咽癌、食管癌等均有較好的放射增敏作用［1-3］，尤其是其聯合順鉑在治療非小細胞性肺癌中，確實有明顯的放療增敏作用。CMNa對放療的增敏效應主要是通過親電子作用對受損腫瘤細胞進行親合，固定損傷;另一方面還可以抑制DNA聚合酶β(DNA polymerase β，Polβ)對腫瘤細胞中受損DNA進行修復［4］。

順鉑是細胞周期非特異性藥物，能與射線作用在腫瘤細胞的不同亞群，同時能干擾細胞周期的進程，在p53被抑制的腫瘤中，調控細胞周期主要由p21來完成，它是近年來研究細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)抑制家族中的重要成員，受p53正調控，可以對DNA復制引起的損傷進行監測，阻滯細胞周期，從而達到細胞增殖抑制的效果。

目前CMNa在國外研究甚少，大部分都是闡述其對放療增敏具有一定作用，但對其化療增敏方面的研究卻不多［5］，另外CMNa提高增敏作用的機制又是如何呢。本文從NCBI GEO Datasets數據庫(編號為GDS3101)有關順鉑誘發的非小細胞肺癌基因mRNA表達芯片分析結果中選出CDK抑制蛋白1A CDK(inhibitor 1A，CDKN1A;即p21)、sestrin 1 (SESN1)、Fas、鐵氧還蛋白還原酶(ferredoxin reductase，FDXR)和鎂/錳離子依賴的蛋白磷酸酶1D (proteinphosphatase1D，Mg2+/Mn2+-dependent，PPM1D)等5個差異表達基因作為研究對象，它們參與DNA損傷、細胞周期、細胞凋亡等調控。然后通過CMNa與順鉑聯合處理A549肺腺癌細胞，進一步驗證CMNa與順鉑的聯合作用下對這些差異表達基因的影響，從而推測CMNa可能涉及到的對腫瘤細胞治療的機制。所選的這5個基因在順鉑處理后的表達改變以及GO分析結果見表1。

材料和方法

1 材料

2 細胞培養

A549細胞均在5%CO2、37℃的加濕孵箱中培養，培養基為含有10%胎牛血清的DMEM(Gibco)培養基。

3 藥物處理

取對數生長期A549細胞接種于96孔培養板中，每孔細胞數為1×103培養12 h后，順鉑終濃度10 mg/L［6］與CMNa終濃度1 mmol/L培養96 h［1］，每組樣本5個復孔。

4 Real-time PCR檢測

p21 real-time PCR上游引物5’-TGGCACCTCACCTGCTCTG-3’，下游引物5’-CCACCTGGGGACCCTTCA-3’;p21 ChIP檢測上游引物5’-TTGGGCAGCAGGCTGTGGCTC-3’，下游引物5’-GATCCCAGCCCTGTCGCAAGG-3’［7］;p53上游引物5’-AGATTCAGAACGGCTCCTCG-3’，下游引物5’-GGGCACCGCTTCACCA-3’;GAPDH上游引物5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，下游引物5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’。Real-time反應條件:95℃30 s后，95℃5 s，60℃30 s，40個循環。RT-PCR反應條件:95℃30 s后，95℃5 s，60℃30 s，28個循環。

5 Western blotting檢測

細胞裂解提取蛋白后，用SDS-PAGE膠電泳分離，轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，I抗(p21、p53和GAPDH均為1∶1 000稀釋)孵育過夜，HRP標記的II抗室溫孵育1 h，后按試劑盒說明操作。

6 細胞周期檢測

pCDH/HSP27組和陰性對照組U266細胞用終濃度為0、5、10、20、40和80 nmol/L的BTZ處理8 h后，蛋白酶體活性檢測結果（圖8）顯示，隨著BTZ濃度的遞增，2組U266細胞中20S蛋白酶體的活性均被抑制；在10、20、40和80 nmol/L BTZ濃度組中，pCDH/HSP27組U266細胞中20S蛋白酶體的活性均明顯高于陰性對照組（P值均＜0.05）。這一結果表明，HSP27表達上調可減弱BTZ對骨髓瘤細胞蛋白酶體活性的抑制。

收集正常、順鉑單獨處理和CMNa與順鉑聯合處理的懸浮及貼壁A549細胞。制備成單細胞懸液，加入70%乙醇，4℃固定過夜。于次日漂洗2遍，加入50 mg/L RNA酶A。37℃孵育1 h，加入50 mg/L的碘化丙啶，4℃避光1 h，上流式細胞儀進行細胞周期分析。選用FL2-H-PI通道，激發波長為488 nm。

7 ChIP檢測

將種有1×106細胞數目的培養皿倒去培養液，用1%甲醛-PBS溶液20 mL室溫固定10 min，加入1×等體積的glycine-PBS溶液終止固定。PBS沖洗2遍，加入1 mL含有0.5%PMSF的shearing液(新鮮配制)，冰上超聲處理(工作時間10 s，靜置時間30 s，30個循環，功率200 W)。離心取上清得到DNA蛋白混合液(input)，與p53 I抗/IgG、磁珠及苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)一起4℃孵育過夜，次日對反應體系進行解交聯，去除磁珠，將input進行酚氯仿抽提，乙醇沉淀，對p21啟動子序列進行real-time PCR檢測。通過Ct值的高低來評估p53與p21啟動子結合的情況。

8 統計學處理

應用SPSS 15.0統計軟件分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，兩組樣本比較采用t檢驗，多組樣本比較采用方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 驗證芯片中得到的差異表達基因確實在順鉑處理的A549細胞中有高表達

對A549細胞系進行10 mg/L順鉑處理，培養96 h以后，發現細胞數目明顯減少，見圖1;另外檢測了所得差異基因的mRNA表達水平，我們發現這些基因表達水平經順鉑處理而升高，其中p21表達水平最為顯著，見圖2。這與此前研究報道一致［8-9］，同時也證明芯片的數據結果可靠。

2 CMNa與順鉑聯合處理A549細胞系后能有效提高p21的表達

聯合終濃度1 mmol/L CMNa處理A549細胞后檢測mRNA水平，對比順鉑單獨處理組，p21與PPM1D表達升高，且p21上調更為顯著，見圖3。同時p21蛋白水平也在CMNa聯合順鉑處理后有明顯的上調，但是單獨用CMNa處理A549細胞，則p21表達與陰性對照無明顯變化，見圖4，這提示CMNa引起A549細胞p21表達上調需要在順鉑的支持下。

Figure 1.The A549 cells without cisplatin treatment(A)and treated with 10 mg/L cisplatin(B).Magnification: ×40.圖1 未作處理的A549細胞系及用10 mg/L順鉑處理的A549細胞系

Figure 2.The expression of candidate genes in A549 cells treated with cisplatin(Cis)or not.Mean±SD.n=6.*P ＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖2 候選基因在順鉑處理與未處理的A549細胞中的表達

Figure 3.The expression of candidate genes in A549 cells treated with cisplatin(Cis)and CMNa.Mean±SD.n= 6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖3 候選基因在甘氨雙唑鈉聯合順鉑處理的A549細胞中的表達

Figure 4.p21 protein expression in A549 cells treated with cisplatin(Cis)and CMNa.Mean±SD.n=6.＊＊P＜0.01 vs control.圖4 p21蛋白在順鉑和CMNa處理的A549細胞中的表達

3 CMNa與順鉑聯合處理可以提高p53的表達，從而介導p21的上調

CMNa與順鉑聯合處理A549細胞發現CMNa可有效增加p53的表達，見圖5A;接著我們檢測了p21 的5’端區域上p53的結合情況，也發現了p53蛋白水平升高，從而激活了下游p21的轉錄表達，圖5B。

4 CMNa與順鉑聯合處理，可以有效促進A549細胞G1/S期阻滯

CMNa與順鉑聯合處理的A549細胞比單獨順鉑作用的A549細胞G1期細胞明顯減少，S期細胞則明顯增加，但G2/M期細胞數目變化無顯著差異，見圖6、表2。這說明CMNa與順鉑聯合處理可以有效調控p21介導的G1/S期阻滯。

討論

臨床研究表明，以鉑類為基礎的多藥物聯合方案對晚期NSCLC有益［10］，但其療效仍然不理想，文獻數據顯示其客觀有效率為25%～45%，1年生存率僅為40%～50%［11-12］。因此如何有效增加NSCLC化療敏感性，已成為臨床上一重要策略。目前順鉑用于腫瘤治療的機制主要就是對腫瘤細胞周期進行調控［13］，可以引起G1期的阻滯［14］，也可以引起G2/M期的阻滯［15］。而在睪丸癌中發現，順鉑促進下游轉錄起始點p21的激活依賴p53表達的提高［16］。因此其它藥物聯合順鉑的化療方案中，對順鉑介導的腫瘤細胞通路、分子網絡等必然存在進一步促進作用。

CMNa是一種高效低毒的硝基咪唑類放療增敏劑，它本身無抗癌作用，單獨對A549處理CMNa也證實了這一點。CMNa作為腫瘤放化療增敏劑的機制主要包括兩方面，一是通過特異性轉移腫瘤中乏氧細胞受損分子的電子，從而固定治療靶點，來增強治療效果［17］;二是通過抑制Polβ，抑制腫瘤細胞中DNA分子的修復，從而提高化療效果［5］。本文證實了CMNa與順鉑聯合作用下，可以通過介導上調p53表達，從而促進p21的表達。那么CMNa對腫瘤細胞增敏作用很有可能一方面是通過對腫瘤細胞中受損DNA分子進行固定，參與依賴p53途徑的DNA損傷反應，促進p21的表達，通過抑制CDK復合物及增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)［18］，從而提高順鉑對細胞周期的阻滯效應，引起G1/S期阻滯;另一方面又抑制Polβ介導的堿基切除修復。這兩方面的作用下大大提高了順鉑對腫瘤細胞的殺傷作用。然而，CMNa如何協同順鉑有效殺傷腫瘤細胞的具體分子機制有待進一步考察。

Figure 5.p53 expression in A549 cells treated with cisplatin orcombination of CMNa and cisplatin(Cis).A:the protein level of p53;B:p53 protein binding in 5’region of p21 sequence.IgG is a negative control.Mean± SD.n=4.＊＊P＜0.01 vs IgG;##P＜0.01 vs control.圖5 在順鉑處理的A549細胞和順鉑與CMNa聯合處理的A549細胞p53蛋白的表達

Figure 6.Cell cycle detection in A549 cells treated with cisplatin or combination of CMNa and cisplatin by FACS analysis.圖6 順鉑處理的A549細胞和順鉑與CMNa聯合處理的A549細胞細胞周期的變化

表2 CMNa與順鉑聯合處理與單獨順鉑處理對A549細胞細胞周期的影響Table 2.The cell cycle distribution comparison between CMNa with cisplatin group and cisplatin group(%.Mean± SD.n=3)

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Sodium glycididazole combined with cisplatin efficiently promotes p21 expression in lung adenocarcinoma

LIAO Xiao-fang1，ZHAO Zhong-hong1，GUO Shao-wen2，PENG Zheng1，ZHU Xiao-ping1，WANG Yan1，ZOU Yan1，HU Wei1
(1Department of Radiotherapy，Quzhou Central Hospital Affiliated to Zhejiang Province University of Traditional Chinese Medicine，Quzhou 324000，China;2Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200130，China.E-mail:xiaof_cun@126.com)

AIM:To investigate the effect of sodium glycididazole(CMNa)on the sensitivity of lung adenocarcinoma to cisplatin.METHODS:The microarray data of human lung adenocarcinoma A549 cells treated with cisplatin from NCBI public database were reanalyzed for searching the genes with significantly differential expression.The A549 cells were used in the study and treated with CMNa+cisplatin.The expression levels of the verified candidate genes from database searching were detected by real-time PCR.The role of CMNa in the expression of p21 and its upstream target p53 was also determined.RESULTS:A list of candidate genes from the microarray dataanalysis was obtained，in which p21 was verified in A549 cell line treated with cisplatin by database searching and analyzing.A549 cells were treated with CMNa and cisplatin，and p21 expression was enhanced in the cells treated with CMNa+cisplatin but not CMNa alone.In addition，enhanced p21 expression in A549 cells treated with CMNa+cisplatin was mediated by promotion of the upstream p53 level.CONCLUSION:CMNa co-operates with cisplatin to improve p21 expression in human lung adenocarcinoma，which is mediated through enhancement of the p21 upstream target p53，indicating another new insight of CMNa function in radiosensitivity of human lung adenocarcinoma.

Sodium glycididazole;Cisplatin;Lung neoplasms;p21 protein;p53 protein

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.011

1000-4718(2014)02-0256-06

2013-07-28

2013-12-23

浙江省衛生廳基金資助項目(No.2010kyA194)

△通訊作者Tel:0570-3023071;E-mail:xiaof_cun@126.com