沉默NANOG表達對人肝癌細胞HepG2中cyclin D1表達及細胞增殖的影響*

周嘉嘉，陳汝福，鄧小耿，周雨，周泉波，張杰，伍耀豪，曾樂祥，邱榮林

(中山大學孫逸仙紀念醫院外科，廣東廣州 510120)

沉默NANOG表達對人肝癌細胞HepG2中cyclin D1表達及細胞增殖的影響*

周嘉嘉，陳汝福△，鄧小耿，周雨，周泉波，張杰，伍耀豪，曾樂祥，邱榮林

(中山大學孫逸仙紀念醫院外科，廣東廣州 510120)

目的:探討RNA干擾沉默NANOG表達后對肝癌細胞HepG2中細胞周期素D1(cyclin D1)表達及細胞增殖的影響。方法：將以NANOG基因為靶點的NANOG-siRNA瞬時轉染肝癌細胞HepG2，real-time PCR和Western boltting檢測NANOG、cyclin D1 mRNA和蛋白的表達，CCK-8和平板克隆形成實驗檢測細胞增殖能力，流式細胞術檢測細胞周期情況。結果:與mock組比較，轉染NANOG-siRNA后，肝癌細胞HepG2中NANOG、cyclin D1 mRNA和蛋白水平均下調(P＜0.05)，細胞增殖能力下降(P＜0.05)，進入G0/G1期的細胞比例增多(P＜0.05)。結論:沉默NANOG表達可引起肝癌細胞HepG2中cyclin D1的表達下降，導致細胞增殖能力下降。

肝腫瘤;NANOG蛋白;細胞增殖;細胞周期蛋白D1

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，據統計全世界每年新發肝癌患者約60萬，居惡性腫瘤的第5位。目前我國發病人數約占全球的半數以上，占全球肝癌病人的55%，嚴重威脅國人的健康和生命。NANOG是近年來發現的一個維持胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)自我更新和多向分化潛能的重要轉錄因子，是干細胞具有發育成各種類型細胞能力的“總開關”，被認為是全能性或多能性干細胞的標志物［1-3］。研究發現NANOG在乳腺癌、前列腺癌、結腸癌等異常表達，提示NANOG也可能是某些腫瘤的標志之一［4-5］。細胞周期素D1(cyclin D1)作為重要的細胞周期調節因子之一，其過度表達是多種人類原發性腫瘤的特征，對腫瘤的診斷和預后判斷具有重要意義［6］。Cyclin D1蛋白表達增加主要見于一些原發性惡性腫瘤，例如乳腺癌、肝細胞癌［6-7］。本研究通過RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術沉默肝癌細胞HepG2中NANOG的表達，探討其對肝癌細胞cyclin D1表達以及肝癌細胞增殖活性的影響。

材料和方法

1 材料

人肝癌細胞株HepG2由本實驗室保存，RPMI-1640培養基及胰蛋白酶購自Gibco;脂質體2000(LipofectamineTM2000)購自Invitrogen;NANOG和cyclin D1兔抗人單克隆抗體購自CST;總RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen;real-time PCR試劑盒購自TaKaRa;CCK-8試劑購自日本同仁化學研究所。

2 方法

2.1 細胞培養及轉染HepG2細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，置于37℃、5% CO2和相對濕度95%的恒溫培養箱中培養，1～2 d換液。取對數生長期HepG2細胞，接種于6孔培養板中，培養24 h后待細胞融合達85%左右時進行細胞轉染。轉染前2 h更換不含血清的新鮮培養基。設計siRNA干擾序列靶點:GFP 5’-ACT ACC TGT TCC ATG GCC A-3’;NANOG 5’-CCA GAC CTG GAA CAA TTC A-3’;由廣州銳博生物公司合成。實驗分組:以無血清培養基培養+脂質體2000處理組(以下簡稱mock組);脂質體2000轉染GFP-siRNA組(以下簡稱siGFP組);脂質體2000轉染NANOG-siRNA組(以下簡稱siNANOG組)。按脂質體2000轉染試劑盒說明書進行細胞轉染，24～48 h后收集細胞進行后續實驗。如接種在96孔板中，按說明書相應地調整細胞數及轉染試劑量。

2.2 Real-time PCR檢測NANOG mRNA表達細胞轉染24 h后，Trizol法提取各組細胞總RNA，紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度。按real-time PCR試劑盒操作說明書合成cDNA。NANOG(109 bp)上游引物5’-CAG AAG GCC TCA GCA CCT AC-3’，下游引物5’-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3’;βactin(186 bp)上游引物5’-ATT GTT CCA GGT CTG GTT GC-3’，下游引物5’-CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A-3’。PCR反應條件:95℃20 s，95 ℃10 s，60℃30 s，70℃10 s，35個循環。所有標本均重復檢測3次，計算出Ct值，采用2-ΔΔCt法進行計算分析。

2.3 Western blotting測定NANOG和cyclin D1蛋白的表達細胞轉染48 h后，按說明書提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。配制10%SDS-PAGE凝膠，各上樣孔加入25 μg蛋白樣品，電泳后轉印至硝酸纖維素膜(PVDF)膜上。PVDF膜以50 g/L脫脂奶粉封閉2 h。分別加入NANOG和cyclin D1兔抗人單克隆Ⅰ抗(1∶1 000)于4℃孵育過夜。經TBST漂洗3次后，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔Ⅱ抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，ECL化學發光法試劑盒顯影、曝光。經Bio-Rad公司圖形分析軟件Quantity One對圖片進行分析并測定灰度值。

2.4 CCK-8法檢測細胞增殖情況取對數生長期HepG2細胞，接種于96孔板，培養24 h，轉染siRNA。細胞轉染后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h，更換為不含血清的新鮮培養基，并加入10 μL CCK-8試劑。置于37℃孵育2 h，用酶標儀測定450 nm的吸光度，每個時點每組設5個復孔。

2.5 平板克隆形成實驗細胞轉染24 h后，將細胞用胰酶消化后吹散成單細胞懸液，取500個細胞接種于培養皿中，每組設3個重復孔。于37℃、5% CO2和相對濕度95%的恒溫培養箱中培養7d。用多聚甲醛固定，1%結晶紫染色。顯微鏡下計算克隆形成數(含有10個細胞以上的集落為1個克隆)，克隆形成率(%)=克隆形成數/接種細胞數×100%。

2.6 流式細胞術測定細胞周期細胞轉染48 h后，收集細胞，用PBS制備成單細胞懸液，用75%乙醇4℃固定過夜，固定后細胞經PBS洗滌2次。避光條件下加入PI染液，室溫孵育30 min，上流式細胞儀分析樣品，測定細胞周期。

3 統計學處理

數據用均數±標準差(mean±SD)表示，用SPSS 13.0統計軟件進行分析，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 RNAi對NANOG表達的影響

Real-time PCR檢測顯示，siNANOG組NANOG mRNA表達水平均較mock組明顯下降，比值為0.340±0.055，差異有統計學意義(P＜0.05); siGFP組與mock組相比NANOG mRNA表達水平無明顯差異，比值為0.980±0.038(P＞0.05)，見圖1。Western blotting結果顯示，siNANOG組NANOG蛋白表達水平較mock組明顯下降，灰度比值為0.430±0.077，差異有統計學意義(P＜0.05);siGFP組與mock組的NANOG蛋白表達水平則無明顯差異，灰度比值為0.960±0.047(P＞0.05)，見圖2。

Figure 1.NANOG mRNA expression in HepG2 cells.Mean± SD.n=3.*P＜0.05 vs mock.圖1 HepG2細胞中NANOG mRNA的表達

Figure 2.NANOG protein expression in HepG2 cells.Mean± SD.n=3.*P＜0.05 vs mock.圖2 HepG2細胞中NANOG蛋白的表達

2 NANOG對細胞生長曲線的影響

CCK-8實驗結果顯示，siNANOG組細胞在48～72 h吸光度值顯著低于mock組，差異有統計學意義(P＜0.05);siGFP組與mock組相比無顯著差異(P＞0.05)，見圖3。

3 NANOG對細胞克隆形成的影響

各組克隆形成率:siNANOG組為(7.4±3.8)%，siGFP組為(16.8±2.5)%，mock組為(17.3± 2.2)%。siNANOG組細胞克隆形成率低于mock組，差異有統計學意義(P＜0.05);siGFP組與mock組細胞克隆形成率無明顯差異(P＞0.05)，見圖4。

Figure 3.Proliferation curves of HepG2 cells.Mean±SD.n= 5.*P＜0.05 vs mock.圖3 HepG2細胞增殖曲線

Figure 4.Flat plate colony formation assay of HepG2 cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs mock.圖4 HepG2細胞的克隆形成率

4 NANOG對細胞周期的影響

流式細胞術結果顯示，與mock組細胞G0/G1期(57.8±5.05)%相比，siNANOG組細胞G0/G1期百分比升高，為(74.6±8.21)%，S+G2/M期細胞數相應下降，差異有統計學意義(P＜0.05)。siGFP組與mock組細胞G0/G1期百分比無明顯差異(P＞0.05)，見圖5。

5 NANOG對cyclin D1蛋白表達的影響

Real-time PCR檢測顯示，采用siRNA抑制NANOG表達后siNANOG組細胞cyclin D1 mRNA表達水平均較mock組明顯下降，比值為0.390± 0.067，差異有統計學意義(P＜0.05);siGFP組與mock組相比，cyclin D1 mRNA表達水平則無明顯差異，比值為0.950±0.054(P＞0.05)，見圖6。Western blotting結果顯示，siNANOG組的cyclin D1蛋白表達水平較mock組明顯下降，灰度比值為0.400±0.075，差異有統計學意義(P＜0.05);siGFP組與mock組的cyclin D1蛋白表達水平則無明顯差異，灰度比值為0.920±0.063(P＞0.05)，見圖7。這表明RNAi沉默NANOG表達后降低HepG2細胞中cyclin D1 mRNA和蛋白的表達。

Figure 5.Cell cycle assay of HepG2 cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs mock.圖5 HepG2細胞的細胞周期情況

Figure 6.Cyclin D1 mRNA expression in HepG2 cells.Mean± SD.n=3.*P＜0.05 vs mock.圖6 HepG2細胞中cyclin D1 mRNA的表達

Figure 7.Cyclin D1 protein expression in HepG2 cells.Mean ±SD.n=3.*P＜0.05 vs mock.圖7 HepG2細胞中cyclin D1蛋白的表達

討論

2003年Chambers和Mitsui幾乎同時報道了一種在囊胚內細胞群、原始生殖細胞及胚胎干細胞系表達的新轉錄因子，命名為NANOG，意即“生命綠洲”和“永不枯竭”［1-2］。在ESCs中，NANOG可特異性結合下游靶基因啟動子區域ATTA結合元件，發揮轉錄調節作用，維持ESCs自我更新和多向分化潛能［3，8］。最初以為NANOG只在胚胎干細胞、胚胎生殖細胞以及胚胎癌細胞等多能性細胞中表達，在正常成體組織中不表達。近年研究發現NANOG在精原細胞瘤、乳腺癌、前列腺癌和視網膜母細胞瘤等異常表達［4-5，9-10］。實驗證實，將NANOG基因轉入造血干細胞后，引起了γδT細胞惡性腫瘤的發生，研究者認為NANOG是一種癌基因，可導致惡性轉化［11］。外源表達NANOG能促進NIH3T3細胞增殖，使細胞生長速度加快［12］。研究還發現，NANOG還與腫瘤進展有關:下調NANOG表達可阻止腫瘤惡性進展，在某些情況下，改變了細胞分化［4］。本研究結果顯示，以未處理的mock組作為對照，肝癌細胞HepG2在轉染NANOG-siRNA后，NANOG mRNA和蛋白表達水平均顯著下降;細胞生長曲線及克隆形成實驗顯示，下調NANOG表達后HepG2細胞增殖能力減弱，增殖速度下降，而轉染GFP-siRNA 的HepG2細胞和mock組之間沒有明顯差異，表明下調NANOG表達可抑制肝癌細胞HepG2的細胞增殖。

細胞周期是細胞生命活動的基本過程，主要分為4個時期G1期、S期、G2和M期，遵循G1-S-G2-M演變規律，其中G1/S和G2/M為2個重要的檢查點，而前者尤為重要。細胞一旦從G1跨入S則不再依靠外來信息刺激而自動完成分裂過程［13］。在G1/S期，cyclin D1是G1期進展的限速控制因素，在調控細胞增殖及細胞周期進程中有重要意義［6］。軟件分析發現cyclin D1基因啟動子區域存在2個以上ATTA結合元件，這為NANOG直接調控cyclin D1基因的轉錄和表達提供了可能。本研究結果顯示，轉染NANOG-siRNA后，cyclin D1 mRNA和蛋白表達水平均顯著下降，轉染GFP-siRNA的細胞和mock組之間則沒有明顯差異，表明下調NANOG表達可以降低肝癌細胞HepG2中cyclin D1蛋白的表達水平，NANOG可能是通過特異性結合cyclin D1基因啟動子區域ATTA結合元件而發揮轉錄調控活性的。流式細胞術結果顯示，轉染NANOG-siRNA后，進入G0/G1期的細胞較mock組明顯增多，轉染GFP-siRNA的細胞與mock組之間則沒有明顯差異，表明下調NANOG表達可以調節細胞周期的進程，而下調NANOG表達對細胞增殖及細胞周期的影響主要是通過阻滯細胞周期于G0/G1期實現的，這一功能的實現可能與下調NOANG表達后對cyclin D1的抑制作用有關。

綜上所述，通過RNAi技術沉默NANOG表達，可引起人肝癌細胞HepG2中cyclin D1表達的下降，細胞增殖能力的減弱以及細胞周期的改變。NANOG可能是通過作用于cyclin D1基因啟動子區域的ATTA結合元件而調節cyclin D1的轉錄活性，進而下降cyclin D1的表達水平。Cyclin D1可能參與了NANOG對細胞增殖及細胞周期的調控作用。

［1］Chambers I，Colby D，Robertson M，et al.Functional expression cloning of Nanog，a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells［J］.Cell，2003，113 (5):643-655.

［2］Mitsui K，Tokuzawa Y，Itoh H，et al.The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells［J］.Cell，2003，113(5): 631-642.

［3］Silva J，Nichols J，Theunissen TW，et al.Nanog is the gateway to the pluripotent ground state［J］.Cell，2009，138(4):722-737.

［4］Jeter CR，Badeaux M，Choy G，et al.Functional evidence that the self-renewal gene NANOG regulates human tumor development［J］.Stem Cells，2009，27(5):993-1005.

［5］Gu G，Yuan J，Wills M，et al.Prostate cancer cells with stem cell characteristics reconstitute the original human tumor in vivo［J］.Cancer Res，2007，67(10):4807-4815.

［6］Musgrove EA，Caldon CE，Barraclough J，et al.Cyclin D as a therapeutic target in cancer［J］.Nat Rev Cancer，2011，11(8):558-572.

［7］劉娟，殷飛，姚樹坤，等.細胞周期素D1、視網膜母細胞瘤樣蛋白2及微小染色體維持蛋白7在肝細胞癌中的表達及對預后的意義［J］.中國病理生理雜志，2011，27(2):304-309.

［8］Boyer LA，Lee TI，Cole MF，et al.Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells［J］.Cell，2005，122(6):947-956.

［9］Ezeh UI，Turek PJ，Reijo RA，et al.Human embryonic stem cell genes OCT4，NANOG，STELLAR，and GDF3 are expressed in both seminoma and breast carcinoma ［J］.Cancer，2005，104(10):2255-2265.

［10］Seigel GM，Hackam AS，Ganguly A，et al.Human embryonic and neuronal stem cell markers in retinoblastoma ［J］.Mol Vis，2007，13:823-832.

［11］Tanaka Y，Era T，Nishikawa S，et al.Forced expression of Nanog in hematopoietic stem cells results in a γδT-cell disorder［J］.Blood，2007，110(1):107-115.

［12］Zhang J，Wang X，Chen B，et al.Expression of Nanog gene promotes NIH3T3 cell proliferation［J］.Biochem Biophys Res Commun，2005，338(2):1098-1102.

［13］Fry AM，O＇Regan L，Sabir SR，et al.Cell cycle regulation by the NEK family of protein kinases［J］.J Cell Sci，2012，125(Pt 19):4423-4433.

Effect of NANOG silencing on cyclin D1 expression and proliferation in human hepatoma HepG2 cells

ZHOU Jia-jia，CHEN Ru-fu，DENG Xiao-geng，ZHOU Yu，ZHOU Quan-bo，ZHANG Jie，WU Yao-hao，ZENG Le-xiang，QIU Rong-lin
(Department of Surgery，Sun Yat-sen Memorial Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510120，China.E-mail: chenrf63@163.com)

AIM:To investigate the effect of NANOG silencing on cyclin D1 expression and proliferation in human hepatoma HepG2 cells.METHODS:Transient transfection of NANOG targeting siRNA into HepG2 cells was performed.The expression of NANOG and cyclin D1 at mRNA and protein levels was detected by real-time PCR and Western blotting.Cell proliferation was examined by CCK-8 assay and colony formation assay，and cell cycle was tested by flow cytometry.RESULTS:After transfection with NANOG-targeting siRNA，the inhibition of NANOG expression was observed.Compared with mock group，the mRNA and protein expression levels of NANOG and cyclin D1 were decreased(P＜0.05).In addition，knockdown of NANOG expression inhibited the cell proliferation and increased the proportion of G0/ G1-phase cells(P＜0.05).CONCLUSION:Silencing of NANOG expression in HepG2 cells causes down-regulation of cyclin D1 expression and decreases the cell proliferation ability.

Liver neoplasms;NANOG protein;Cell proliferation;Cyclin D1

R735.7

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.009

1000-4718(2014)02-0245-05

2013-09-15

2013-12-02

國家自然科學基金資助項目(No.30872485;No.81000889)

△通訊作者Tel:020-81332020;E-mail:chenrf63@163.com