嚴金海，王志強，韓西群，陳少紅，周新華，簡文靜，葛娟，趙彤

(南方醫科大學南方醫院病理科，基礎醫學院病理學系，廣東廣州 510515)

Hsa-miR-150過表達誘導彌漫大B淋巴瘤細胞系OCI-Ly10再分化*

嚴金海，王志強，韓西群，陳少紅，周新華，簡文靜，葛娟，趙彤△

(南方醫科大學南方醫院病理科，基礎醫學院病理學系，廣東廣州 510515)

目的:探究hsa-miR-150過表達誘導彌漫大B淋巴瘤細胞系OCI-Ly10再分化的機制。方法：運用real-time PCR檢測hsa-miR-150在永生化CD19+B細胞和OCI-Ly10細胞中的表達，利用Western blotting和免疫熒光細胞化學檢測hsa-miR-150靶基因c-myb的表達;通過LipofectamineTM2000脂質體法將含有重組慢病毒質粒的病毒上清轉染OCI-Ly10細胞(Ly10-control組和Ly10-miR-150組);對新構建的細胞亞系，通過MTT法檢測細胞增殖能力，流式細胞術檢測細胞周期及凋亡;運用real-time PCR、免疫熒光細胞化學和Western blotting檢測Ly10-control 和Ly10-miR-150的B細胞分化相關基因及c-Myb的表達;利用干擾片段干擾OCI-Ly10細胞c-myb表達后，運用real-time PCR和Western blotting檢測干擾效率及干擾后轉錄調節因子BCL6和漿細胞分化開關蛋白PRDM1的表達。結果:(1)CD19+B淋巴細胞的hsa-miR-150表達量明顯高于OCI-Ly10細胞(P＜0.05);c-Myb在OCI-Ly10細胞中表達較強，而在CD19+B淋巴細胞表達較弱。(2)OCI-Ly10細胞經轉染hsa-miR-150后，B細胞分化相關基因的表達都明顯發生了變化，B細胞特異性激活蛋白(PAX5)和BCL6表達下調(P＜0.05);干擾素調節因子4(IRF4)、PRDM1和X盒結合蛋白1(XBP1)的表達上調(P＜0.05);和對照組相比，c-Myb在Ly10-miR-150細胞中表達明顯下調(P＜0.05)。(3)干擾OCI-Ly10細胞c-myb表達后，BCL6表達明顯下調，而PRDM1表達明顯上調。結論:(1)hsa-miR-150過表達對OCI-Ly10細胞抑制增殖和誘導凋亡作用非常明顯。(2)過表達hsa-miR-150可誘導該瘤細胞向末端B細胞方向分化，作用機制可能與下調其靶基因c-myb的表達有關。

彌漫大B細胞淋巴瘤;分化;Hsa-miR-150;基因，c-myb

彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是一種高度異質性惡性淋巴瘤，約占成人非霍奇金淋巴瘤30%～40%，近年來發病率逐年升高［1］。許多證據表明淋巴瘤的發生是由于正常淋巴細胞分化紊亂或分化阻滯的結果［2］。研究發現miRNA在B細胞分化過程中發揮重要作用，Zhou等［3］研究發現hsa-miR-150對B細胞的發育分化至關重要，隨著B細胞發育的不斷成熟，hsa-miR-150的表達量逐步升高。有文獻報道與正常B細胞相比，在不同亞類DLBCL細胞系中hsa-miR-150普遍低表達［4］。本課題組前期研究發現hsa-miR-150在伯基特淋巴瘤細胞株中明顯低表達，再表達hsamiR-150后可以通過調控其靶基因c-myb誘導EB病毒陽性伯基特淋巴瘤細胞株向末端B細胞方向分化［5］。那么在DLBCL細胞系中，hsa-miR-150的表達紊亂是否與瘤細胞分化相關呢?本研究通過構建含有hsa-miR-150重組慢病毒質粒的病毒上清轉染的DLBCL細胞系OCI-Ly10，探討hsa-miR-150與DLBCL細胞系OCI-Ly10分化的關系，為后續研究hsa-miR-150在侵襲性B細胞淋巴瘤分化的作用機制提供更多信息。

材料和方法

1 細胞系來源和培養

OCI-Ly10細胞是人彌漫大B淋巴瘤細胞株，由復旦大學附屬腫瘤醫院惠贈［6］。CD19+B細胞是EB病毒轉化的永生化B淋巴細胞，為本實驗室保存。細胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，取對數期、生長狀態良好的細胞進行后續實驗。

2 主要試劑

鼠抗人轉錄調節因子BCL6抗體、鼠抗人干擾素調節因子4(interferon regulatory factor 4，IRF4)抗體、免疫熒光Ⅱ抗和Western blottingⅡ抗均購自北京中杉金橋生物公司;兔抗c-Myb單抗購自Abcam。MTT為廣州市威佳科技有限公司產品。DMSO和RPMI-1640、IMDM培養基均購自吉諾生物醫藥技術有限公司。胎牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產品。miRNA快速提取試劑盒購自BioTeke。miRNA逆轉錄和real-time PCR試劑盒All-in-OneTMmiRNA Q-PCR Detection Kit購自Genecopoeia。DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。蛋白提取試劑盒、蛋白質濃度測定試劑盒購自上海申能博彩生物科技有限公司。PVDF膜購自Millipore。其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。所用引物由上海吉凱基因技術有限公司根據設計合成，見表1。靶向c-myb的siRNA序列(5’-AAGCTGAAGAAGCTGGTGGAA-3’)由Sigma公司合成。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

3 主要方法

3.1 Real-time PCR采用RNeasy Mini試劑盒分離純化各組細胞的總RNA，分光光度法測定計算提取的總RNA含量及濃度。參照TaKaRa試劑盒實驗操作說明進行real-time PCR，總反應體積25.0 μL，其中Premix Taq 12.5 μL，cDNA 2.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，去RNA酶水9.5 μL。擴增條件為:37℃逆轉錄15 min，85℃滅活5 s;95℃10 min;95℃10 s，60℃20 s，72℃34 s，40個循環。7500熒光定量PCR儀(Ambion)上機，反應結束后，立即進行擴增曲線和融解曲線分析，由公式2-ΔΔCt計算各目的基因與內參照基因相對表達量。實驗重復3次。

3.2 Western blotting和免疫熒光細胞化學染色離心收集對數生長期狀態良好細胞。采用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，用BCA法測定蛋白質濃度，進行10%SDS-PAGE，100 mA電轉PVDF膜2 h，5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h。用Ⅰ抗稀釋液按1∶10 000稀釋c-myb抗體，1∶500稀釋β-actin抗體，抗體和PVDF膜4℃孵育過夜。1∶5 000稀釋山羊抗兔lgG/辣根酶標記Ⅱ抗和1∶5 000稀釋山羊抗鼠IgG/辣根酶標記Ⅱ抗，孵育1 h，增強化學發光顯影。共聚焦顯微鏡免疫熒光細胞化學染色操作步驟:收集懸浮培養細胞后洗滌并用4%多聚甲醛室溫固定20～30 min。每孔加入Triton X-100 150 μL破膜;10%羊血清(150 μL/well)封閉20 min，棄去上清，不洗;用Ⅰ抗稀釋液按1∶100稀釋兔抗c-Myb單抗;1∶100稀釋兔抗BCL6多克隆抗體;1∶100稀釋鼠抗PRDM1單抗，4℃冰箱過夜，次日室溫孵育30 min。根據Ⅰ抗屬性，每孔分別加入羊抗兔Ⅱ抗(TRITC標記)和羊抗鼠Ⅱ抗(TRITC標記)，稀釋比例均為1∶100，室溫避光孵育1 h;DAPI復染;熒光共聚焦顯微鏡(Olympus)觀察，每組細胞取5個不同高倍鏡視野觀察并計數。

3.3 Hsa-miR-150慢病毒載體的構建及轉染構建的pEZX-miR-150-EGFP重組慢病毒載體送Invitrogen公司測序，結果表明，所獲得的has-miR-150前體基因及其側翼序列與GenBank所公布的相應序列相符，無堿基缺失及錯誤。將測序結果輸入PubMed數據庫，運用BLAST程序進行比對分析，與GenBank所公布的相應序列has-miR-150前體基因及其側翼序列完全一致。將包膜質粒(pMD2.G)、包裝結構質粒(psPAX2)和目的基因重組質粒(感染組含有pEZX-hsa-miR-150-EGFP，即含有hsa-miR-150病毒和EGFP;未感染組僅含pEZX-EGFP，即僅含EGFP)3種質粒，通過LipofectamineTM2000共同轉染至包裝細胞293FT中，共感染24 h，換新鮮培養基。感染后每天倒置熒光顯微鏡下觀察各組細胞EGFP表達情況，并計算EGFP陽性細胞的百分比。收集病毒上清;將含有重組慢病毒質粒(感染組和未感染組)的病毒上清轉染OCI-Ly10細胞株，分別命名為Ly10-control和Ly10-miR-150組。

3.4 MTT比色法和流式細胞術將對數生長期的Ly10-miR-150和Ly10-control兩組細胞懸液分別接種到96孔板中，每種細胞每天設置5個復孔，每孔接種細胞約2×103個，觀察7 d。37℃、5%CO2培養箱中培養6 h。每孔加20 μL MTT，繼續培養4～5 h，將細胞培養液上清棄去，每孔加入200 μL DMSO，搖床混勻約10 min;以生長時間為橫坐標，連續檢測7 d，以波長570 nm處吸光度(A)為縱坐標繪制細胞生長曲線。流式細胞術檢測細胞增殖，收取對數生長期的Ly10-control和Ly10-miR-150細胞，進行PI染色:加無水乙醇固定30 min，用冷PBS離心洗滌1次，去上清后加入DNA染液室溫30 min，上機，計算細胞增殖中各期的百分數。流式細胞術檢測細胞凋亡根據Hoechst 33342/PI雙染試劑盒操作要求進行。

3.5 mRNA干擾取1 OD的干擾片段加250 μL DEPC水重懸，配成濃度為20 μmol/L，分裝后-20℃避光保存;取對數期、生長狀態良好的實驗細胞，細胞計數，用RPMI-1640培養基調整至1×109/L，每孔1.5 mL接種于6孔板;實驗分為實驗組(c-myb siRNA，即含干擾片段)、空白對照組(Negative siRNA，即不含干擾片段)，每組設3個復孔;轉染過程參照LipofectamineTM2000說明書:先分別將10 μL LipofectamineTM2000和250 μL Opti-MEM培養基混合配成A液，室溫孵育5 min，再加入到配好的B液中(10 μL實驗干擾片段稀釋液和空白對照組分別與250 μL Opti-MEM培養基混合)配制轉染混合液，十字法混勻，分別加至實驗細胞;48 h后收細胞提取總RNA或者蛋白。

4 統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件分析。數據以均數±標準差(mean±SD)表示。組間比較采用兩獨立樣本t檢驗或兩獨立樣本非參數檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 Hsa-miR-150和c-Myb在CD19+B及OCI-Ly10細胞中的表達

Real-time PCR結果顯示CD19+B淋巴細胞的hsa-miR-150表達明顯高于OCI-Ly10細胞(P＜0.01)，見圖1A。Western blotting和免疫熒光細胞化學的結果都顯示c-Myb在OCI-Ly10細胞中表達較高，而在CD19+B淋巴細胞中表達較低，見圖1B、C。

2 轉染OCI-Ly10細胞48 h后2組細胞hsa-miR-150的表達

轉染48 h后，與Ly10-control組(1.00±0.00)相比，Ly10-miR-150組中hsa-miR-150表達量(44.23± 0.81)明顯增高(P＜0.05)。

3 轉染OCI-Ly10細胞48 h后2組細胞的增殖、細胞周期和凋亡

轉染48 h后，MTT比色法結果顯示Ly10-miR-150細胞的增殖能力明顯低于Ly10-control細胞(P＜0.05)，見圖2A;流式細胞術檢測Ly10-control 和Ly10-miR-150細胞的細胞周期，計算各組細胞的增殖率［(S期+G2期)%］，Ly10-miR-150細胞的增殖率明顯低于Ly10-control細胞(P＜0.05)，見圖2B、C;Ly10-miR-150細胞的凋亡率明顯高于Ly10-control細胞(P＜0.05)，見圖2D。

Figure 1.Expression of hsa-miR-150 in OCI-Ly10 and CD19+B cell lines detected by real-time PCR(A)and expression of c-Myb protein in the 2 cell lines detected by Western blotting(B)and immunofluorescence cytochemistry(C).Mean±SD.n= 3.＊＊P＜0.01 vs OCI-Ly10.圖1 Hsa-MiR-150和c-Myb在CD19+B及OCI-Ly10細胞中的表達

Figure 2.The cell proliferation detected by MTT assay(A)and flow cytometry(B，C)，and the cell apoptosis detected by flow cytometry(D)48 h after transfection.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs Ly10-control.圖2 轉染48 h后檢測各細胞亞系的增殖和凋亡

4 轉染OCI-Ly10細胞48 h后2組細胞的B細胞分化相關基因和c-Myb的表達

Real-time PCR檢測結果發現，與Ly10-control細胞相比，Ly10-miR-150細胞B細胞分化相關基因的表達發生了明顯變化，PAX5和BCL6表達明顯下調(P＜0.05)，而IRF4、PRDM1和XBP1的表達顯著上調(P＜0.05)，見圖3;real-time PCR、Western blotting及免疫熒光細胞化學檢測2組細胞c-Myb的表達，與Ly10-control細胞相比，Ly10-miR-150細胞中c-Myb表達明顯下調，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖4。

5 干擾OCI-Ly10細胞c-myb表達48 h后B細胞分化相關基因的表達

干擾片段干擾OCI-Ly10細胞c-myb表達48 h后，c-myb mRNA表達明顯下調(P＜0.05)，見圖5A。Real-time PCR和Western blotting結果顯示，干擾OCI-Ly10細胞c-myb表達48 h后BCL6表達明顯下調，而PRDM1表達明顯上調(P＜0.05)，見圖5B、C。

Figure 3.The mRNA expression of B-lymphocyte differentiationrelated genes 48 h after transfection.Mean±SD.n= 5.*P＜0.05 vs Ly10-control.圖3 轉染48 h后檢測各細胞亞系的B細胞分化相關基因的表達

Figure 4.Expression of c-Myb detected by real-time PCR(A)，Western blotting(B)and immunofluorescence cytochemistry(C)48 h after transfection.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs Ly10-control.圖4 轉染48 h后檢測各細胞亞系c-Myb的表達

Figure 5.Expression of c-myb mRNA detected by real-time PCR (A)and expression of BCL6 and PRDM1 detected by real-time PCR(B)and Western blotting(C)48 h after interfernce.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs Negative siRNA.圖5 干擾48 h后檢測c-myb mRNA表達及BCL6和PRDM1的表達

討論

1 Hsa-miR-150過表達對OCI-Ly10細胞增殖、細胞周期和凋亡的影響

miRNA是一類內源性RNA小分子，miRNA具有高度保守性、時序性、組織細胞特異性，能在轉錄后水平調控基因的表達，主要作為基因表達的負性調控因子［7］。本研究發現hsa-miR-150在DLBCL細胞系OCI-Ly10細胞中表達很弱，甚至基本不表達。為進一步探究hsa-miR-150的生物學功能，我們構建了穩定表達hsa-miR-150的DLBCL細胞亞系Ly10-miR-150，先運用MTT法和流式細胞術檢測新構建的細胞亞系的增殖能力、細胞周期及凋亡。結果發現上調hsa-miR-150的表達，OCI-Ly10細胞的增殖能力明顯下降，凋亡指數顯著增加，證實hsa-miR-150具有明顯抑制彌漫大B淋巴瘤細胞系OCI-Ly10增殖、促進該瘤細胞凋亡的作用。

2 Hsa-miR-150過表達誘導OCI-Ly10細胞向末端B細胞方向分化

許多證據表明淋巴瘤的發生是由于正常淋巴細胞分化紊亂或分化阻滯的結果［2］。有研究證實hsamiR-150的表達水平與造血細胞的分化關系非常密切，尤其是B細胞的分化發育，隨著B淋巴細胞從祖B細胞向成熟B細胞方向分化發育，hsa-miR-150表達水平逐步升高［8］。如果我們糾正該彌漫大B淋巴瘤細胞系OCI-Ly10中hsa-miR-150的紊亂表達是否也對其瘤細胞分化產生影響呢?為此，我們對新構建的細胞亞系檢測了幾個與B細胞分化密切相關基因的表達。PAX5是一個非常重要的轉錄因子，在B細胞的分化中起非常重要的作用;PAX5在B細胞分化成熟過程中持續表達，但在漿細胞(末端B細胞)階段不表達，PAX5可以通過抑制PRDM1和XBP1的表達，阻止B細胞向漿細胞方向分化，維持B細胞的特征［9］;在某些淋巴瘤中，PAX5異常持續高表達有可能阻止了B細胞向漿細胞方向分化，導致B細胞分化阻滯或紊亂，促進腫瘤的發生［10］。BCL6是一種轉錄抑制因子，它可以調控生發中心B細胞的分化，是生發中心B細胞的重要標記［11］;BCL6通過抑制PRDM1的表達，阻止生發中心B細胞向漿細胞方向分化［12］;在部分DLBCL病例中，可以檢測到BCL6對p53的抑制，阻止腫瘤細胞凋亡，說明BCL6的持續高表達與淋巴瘤的發生也存在著密切關系［13］。IRF4是干擾素調控因子家族中的重要成員，它在調控B細胞向漿細胞分化中起著非常重要的作用［14］;在正常淋巴結的生發中心，IRF4和BCL6的表達相互排斥。也就是說IRF4可以抑制BCL6的表達，促使B細胞向漿細胞方向分化。XBP1是除PRDM1外另一個重要的漿細胞的免疫分化標記，隨著漿細胞的分化成熟，XBP1的表達量逐步升高; PRDM1的表達可以進一步促進XBP1的表達上調，進而促使B細胞向漿細胞方向分化［10］。總之，PAX5 和BCL6抑制B細胞向末端B細胞方向分化，而IRF4、XBP1和PRDM1促進B細胞向末端B細胞方向分化。我們的研究發現在OCI-Ly10細胞上調hsamiR-150后，B細胞分化相關基因PAX5、BCL6、IRF4、PRDM1和XBP-1的表達水平都發生了明顯變化:PAX5和BCL6表達水平的下調打破了腫瘤細胞的分化阻滯狀態;而IRF4、PRDM1和XBP-1的表達水平上調，促進了OCI-Ly10細胞朝末端B細胞方向分化。

有研究在大鼠動物模型體內發現，hsa-miR-150是通過負性調節c-Myb表達來控制pro-B向pre-B細胞分化的［8］。本課題組前期實驗結果中也發現hsa-miR-150可以通過調控c-Myb誘導人類EB病毒陽性伯基特淋巴瘤細胞向末端B細胞方向分化［5］。那么在本實驗中hsa-miR-150是否是通過下調其靶基因c-myb從而打開分化開關蛋白PRDM1、誘導DLBCL細胞系OCI-Ly10細胞再分化的呢?本實驗結果發現c-Myb在OCI-Ly10細胞過表達hsa-miR-150后無論在mRNA水平還是蛋白水平，其表達水平都明顯下調。那么OCI-Ly10細胞分化基因的明顯改變是否由于c-Myb下調引起的呢?因此，我們利用干擾片段干擾了OCI-Ly10細胞中c-myb的表達，然后在mRNA和蛋白水平分別檢測了2個最重要的分化免疫標記BCL6和PRDM1的表達。在cmyb干擾48 h后的OCI-Ly10細胞，BCL6的表達顯著下調，同時分化開關蛋白PRDM1的表達顯著上調，呈現了與過表達hsa-miR-150相似的結果。這表明過表達hsa-miR-150可以誘導OCI-Ly10細胞朝末端B細胞方向再分化，其機制可能與下調其靶基因c-myb的表達有關。

綜上所述，hsa-miR-150對DLBCL細胞系OCILy10細胞的增殖抑制和誘導凋亡作用非常顯著，過表達hsa-miR-150可以誘導該瘤細胞朝末端B細胞方向再分化，其機制可能與下調其靶基因c-myb的表達有關。本研究結果為后續探究hsa-miR-150在侵襲性B細胞淋巴瘤分化中的作用機制提供了更多的信息。

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Over-expression of hsa-miR-150 induces re-differentiation of diffuse large B-cell lymphoma cell line OCI-Ly10

YAN Jin-hai，WANG Zhi-qiang，HAN Xi-qun，CHEN Shao-hong，ZHOU Xin-hua，JIAN Wen-jing，GE Juan，ZHAO Tong
(Department of Pathology，Nanfang Hospital，Department of Pathology，School of Basic Medical Science，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China.E-mail:zhaotongketizu@126.com)

AIM:To investigate the mechanism that over-expression of hsa-miR-150 induces the re-differentiation of diffuse large B-cell lymphoma cell line OCI-Ly10.METHODS:The expression level of hsa-miR-150 in CD19+B and OCI-Ly10 cell lines was detected by real-time PCR.The expression level of c-Myb was detected by Western blotting and immunofluorescence cytochemistry methods.Lentiviral supernatant containing recombinant plasmids was transfected into OCI-Ly10 cells by LipofectamineTM2000 and named Ly10-control and Ly10-miR-150.The biological functions of the 2 cell sublines were identified by MTT assay.The cell cycle and apoptotic rates were detected by flow cytometry.The expression levels of B-lymphocyte differentiation-related genes and c-myb in Ly10-control and Ly10-miR-150 cells were detected by real-time PCR and Western blotting.When c-myb was interfered in by interference fragment in OCI-Ly10 cells，the interference efficiency and the expression levels of BCL6 and PRDM1 were detected by real-time PCR and Western blotting.RESULTS:The expression level of hsa-miR-150 in CD19+B cells was significantly higher than that in OCI-Ly10 cells.The expression level of c-Myb in OCI-Ly10 cells was higher than that in CD19+B cells.The expression levels of B-lymphocyte differentiation-related genes were changed significantly in OCI-Ly10 cells after transfected with hsa-miR-150.The expression levels of PAX5，BCL6 and c-Myb in Ly10-miR-150 cells were lower than those in Ly10-control cells，but the expression levels of IRF4，PRDM1 and XBP1 were higher than those in Ly10-control cells.The expression level of BCL6 waslower and PRDM1 was higher after interference.CONCLUSION:Hsa-miR-150 plays a significant role in inhibiting proliferation and inducing apoptosis of OCI-Ly10 cells.The mechanism that over-expression of hsa-miR-150 induces OCI-Ly10 cell differentiation toward terminal B cells may be related to the down-regulation of c-myb.

Diffuse large B-cell lymphoma;Differentiation;Hsa-miR-150;Genes，c-myb

R329.21

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.006

1000-4718(2014)02-0226-07

2013-10-11

2013-12-23

國家自然科學基金資助項目(No.81272634)

△通訊作者Tel:020-61648228;E-mail:zhaotongketizu@126.com