rAAV1-SERCA2a轉染改善心力衰竭犬心功能及其機制探討*

米亞非，李小鷹，江建軍，付治卿，魯曉春

(1溫州醫科大學附屬臺州醫院心內科，浙江臺州 317000;2解放軍總醫院老年心血管病一科，北京 100853)

rAAV1-SERCA2a轉染改善心力衰竭犬心功能及其機制探討*

米亞非1，李小鷹2△，江建軍1，付治卿2，魯曉春2

(1溫州醫科大學附屬臺州醫院心內科，浙江臺州 317000;2解放軍總醫院老年心血管病一科，北京 100853)

目的:研究重組1型腺相關病毒(rAAV1)介導的肌漿/內質網Ca2+-ATP酶2a(SERCA2a)基因轉移對心力衰竭(HF)犬心功能的作用并探討其機制。方法：采用快速右心室起搏建立比格犬的HF模型，設對照組、HF組、HF+EGFP組和HF+SERCA2a組(均n=4)。后2組經開胸心肌內注射rAAV1-EGFP或rAAV1-SERCA2a，劑量為1×1012病毒基因組。結果:基因轉移30 d后，HF+SERCA2a組超聲心動圖左室射血分數接近對照組，較HF組明顯改善(P＜0.05)，SERCA2a mRNA較HF組顯著提高(P＜0.05)，SERCA2a蛋白在心肌組織中的表達顯著高于HF組(P＜0.05)，心肌細胞凋亡指數和基質金屬蛋白酶9(MMP-9)表達較HF組顯著降低(P＜0.05)。HF+EGFP組各項觀察指標接近HF組。但是，受磷蛋白mRNA的水平沒有改變。結論:rAAV1-SERCA2a轉染上調HF犬心肌組織SERCA2a的表達，能改善心功能，抑制心室重塑;其機制可能與抑制心肌細胞凋亡、下調MMP-9表達有關。

心力衰竭;快速右心室起搏;肌漿/內質網Ca2+-ATP酶2a;腺相關病毒

心力衰竭(heart failure，HF)在細胞水平的特征是收縮功能的損害和Ca2+穩態的失衡。Ca2+調節不僅決定著心肌收縮，影響心率變化，還對心力衰竭進展過程中的心臟肥厚、重構發揮重要作用，Ca2+調節處于心力衰竭病理生理的中心環節［1］。研究證明，細胞膜和肌漿網膜上幾個與心肌漿/內細胞內鈣調節密切相關的分子在心衰的發病過程中發揮了重要的作用［2-3］。肌漿/內質網Ca2+-ATP酶(sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase，SERCA)位于肌漿網膜上，能將Ca2+從細胞質重攝取入肌漿網腔內，是細胞內Ca2+調節的關鍵酶［4］。SERCA已經分離出了5種亞型，在正常和衰竭心臟中表達的主要是2a亞型(即心臟/慢動作骨骼肌型)。本實驗通過重組1型腺相關病毒(recombinant adeno-associated virus type 1，rAAV1)介導SERCA2a基因轉染，糾正心力衰竭比格犬心肌細胞Ca2+調節的紊亂，觀察對心力衰竭比格犬心功能及心室重構的影響，通過觀察心肌細胞的凋亡情況和基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的表達，探索SERCA2a作用的機制，為SERCA2a臨床應用提供依據。

材料和方法

1 動物

健康比格犬18只，體重9～12 kg，雌雄各半，解放軍總醫院實驗動物中心提供。

2 主要試劑和儀器

攜帶SERCA2a的rAAV1(rAAV1-SERCA2a)和攜帶增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)的rAAV1(rAAV1-EGFP)均由北京本元正陽基因技術股份有限公司包裝，病毒滴度均為1 ×1015viral genomes/L。MMP-9多克隆抗體為Santa Cruz產品;兔多克隆SERCA2a抗體購自Lab Vision; TUNEL試劑盒為Promega產品;山羊抗兔SP檢測試劑盒、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG均為中杉公司產品。埋藏式VOO固定高頻率起搏器為上海復旦大學電子工程系研制，起搏頻率設有230 beats/min和180 beats/min;起搏電極為Medtronic生產;C型臂X線數字減影機為飛利浦產品;心臟彩色超聲心動圖為通用電器公司產品。

3 主要方法

3.1 比格犬心力衰竭模型的建立術前12 h禁食，用3%戊巴比妥鈉按25 mg/kg靜脈麻醉。分離出右頸外靜脈，在X線引導下將電極送至右室心尖。在頸部做一皮囊，置入起搏器，暫停起搏。3 d后通過磁鐵在體外啟動起搏器，起搏器固定頻率230 beats/ min，持續30 d后。再行手術換頻率180 beats/min的起搏器，再持續30 d。術中和術后3 d給予青霉素80 U預防感染。

3.2 基因轉染更換起搏頻率為180 beats/min的起搏器時，手術動物每只注射rAAV1-EGFP或rAAV1-SERCA2a病毒液1 mL。麻醉方法同前，呼吸機支持呼吸。經第4肋間進入胸腔，于左室前壁的左冠狀動脈前降支與左冠狀動脈回旋支之間區域選擇注射點，垂直進針3～5 mm，共選取共10個點依次注射藥液。

3.3 超聲心動圖清醒狀態的比格犬，左胸前區備皮，仰臥于檢查臺上，停止起搏30 min后進行超聲心動圖檢查，指標有左室收縮期內徑(left ventricular diameter during systole，LVSD)、左室舒張期內徑(left ventricular diameter during diastole，LVDD)、左室后壁厚度(leftventricularposteriorwalldimension，LVPWD)、射血分數(ejection fraction，EF)等。

3.4 mRNA檢測基因治療30 d后處死動物，取左心室前壁心肌組織用于檢測SERCA2a和受磷蛋白(phospholamban，PLN)mRNA的表達。

3.4.1 RT-PCR檢測心肌組織中SERCA2a mRNA的表達提取組織中總RNA并取RNA 5 μg進行逆轉錄，取逆轉錄產物2 μL進行PCR反應。以GAPDH為內參照。SERCA2a上游引物5’-CAGCTGCTCTGGGTCAATC-3’，下游引物5’-CAGGTTCCAGGTAGTTGCG-3’，擴增片段長度為613 bp。GAPDH上游引物5’-GATGCTGGTGCTGAGTATGT-3’，下游引物5’-CTTCTGGGTGGCAGTGAT-3’，擴增片段長度為294 bp。PCR反應體系25 μL，反應條件為:94℃5 min，變性，94℃30 s，57.4℃30 s，72℃30 s，72℃7 min，共30個循環。

3.4.2 RT-PCR檢測組織中PLN mRNA的表達PLN上游引物5’-CAAGCACGTCAAAATCTTCAGA-3’，下游引物5’-CTGGTTAGCAGAGCAGTTTTAAAA-3’，擴增片段長度為438 bp。PCR反應體系25 μL，反應條件為:94℃5 min變性，94℃30 s，51.2℃30 s，72℃30 s，72℃7 min，共30個循環。取5 μL延伸PCR產物，1.5%瓊脂糖凝膠電泳后進行計算機圖像分析。

3.5 電鏡檢查取1 mm×1 mm×1 mm心肌組織2～3塊，6%戊二醛固定后依次梯度乙醇脫水，環氧樹脂包埋，制成超薄組織切片，在電子顯微鏡下，觀察心肌組織超微結構變化，選取典型視野拍照。

3.6 組織中SERCA2a和MMP-9免疫組織化學染色

組織用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋切片，具體按SP試劑說明書操作。胞漿棕黃色或棕褐色為陽性。采用Leica Qwin圖像分析軟件計算20個高倍視野的吸光度和積分吸光度值。

3.7 心肌細胞凋亡指數檢測固定心肌組織后制成組織切片，用TUNEL試劑盒檢測。染色后普通光學顯微鏡下(×400)觀察，每張切片觀察5個視野，計數陽性細胞數，計算凋亡指數，取其平均值。凋亡指數(%)=凋亡細胞數/細胞指數×100%。

4 統計學處理

使用SPSS 18.0統計軟件分析。數據以均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

18只比格犬中，1只比格犬在快速起搏(230 beats/min)30 d后猝死，1只比格犬在30 d后更換起搏器和基因轉染后死于嚴重心衰。16只比格犬完成整個實驗過程。快速右心室起搏(230 beats/min)30 d后，全部犬均出現活動能力下降、剩食、氣促、腹脹等明顯的心衰表現。更換頻率起搏器(180 beats/ min)后將16只比格犬隨機分為4個組:(1)對照組4只;(2)HF組4只;(3)HF+EGFP組4只;(4) HF+SERCA2a組4只。

1 超聲心動圖結果

基因轉染30 d后，HF組和HF+EGFP組的LVDD、LVSD和LVPWD較對照組和HF+SERCA2a組顯著增高，EF較對照組和HF+SERCA2a組顯著降低(P＜0.05)，說明HF組和HF+EGFP組比格犬心臟收縮功能明顯受損;HF+SERCA2a組的LVDD、LVSD和LVPWD較對照組增高，EF較對照組降低，但差異未達到統計學意義(P＞0.05)，說明HF+SERCA2a組心臟收縮功能受損不顯著，見表1。

表1 基因轉染30 d后各組比格犬超聲心動圖指標Table 1.Echocardiographic data in each group 30 days after gene transfer(Mean±SD.n=4)

2 心肌組織SERCA2a mRNA的表達

RT-PCR發現，各組心肌組織均見610 bp的條帶。對心肌組織的SERCA2a mRNA的表達進行半定量分析，HF組和HF+EGFP組的SERCA2a mRNA表達與對照組相比顯著降低(P＜0.05)，HF+SERCA2a組與HF組相比顯著增高(P＜0.05)，接近對照組水平，見圖1。

3 心肌組織PLN mRNA的表達

RT-PCR發現，各組心肌組織均見430 bp的條帶。對心肌組織的PLN mRNA表達進行半定量分析，對照組、HF組、HF+EGFP組和HF+SERCA2a 組PLN的表達沒有顯著差異(P＞0.05)，見圖2。

4 電鏡下超微結構變化

對照組心肌纖維完整，橫紋肌結構清晰，Z線清楚，線粒體結構完好無腫脹，嵴突完好，閏盤結構清晰完好;HF組和HF+EGFP組電鏡下心肌纖維呈變性改變，肌絲片狀溶解、斷裂、排列紊亂、水腫，線粒體膨脹，呈氣球樣變，嵴稀疏，部分嵴突消失，空泡化多見，肌漿網擴張，Z線融合，閏盤解離多見;HF+ SERCA2a組肌絲片狀溶解、斷裂、排列紊亂，但程度較HF組、HF+EGFP組減輕，見圖3。

Figure 3.Cardiomyocytes examined by electron microscopy.A: myocardial fibers and Z lines orderly distributed in control group(×25 000);B:part Z lines aggregated and patchy myocardial fibers dissolved or fractured in HF group(×10 000);C:patchy myocardial fibers dissolved in HF+EGFP group(×40 000);D:myocardial fibers and Z lines orderly distributed in HF+ SERCA2a group(×12 000).圖3 心肌細胞電鏡觀察

5 心肌組織中SERCA2a的表達

SERCA2a主要表達于心肌細胞的胞漿，呈棕黃色，在心肌組織內彌漫分布，纖維細胞及血管內皮細胞未見表達，見圖4;其它組織(肝臟、肺臟)未見SERCA2a表達。對各組比格犬的心肌組織SERCA2a的表達進行半定量分析發現，HF組(吸光度值為0.8744±0.0432，積分吸光度值為31.176±3.354)和HF+EGFP組(吸光度值為0.8768±0.0417，積分吸光度值為31.697±3.146)與對照組(吸光度值為1.0539±0.0486，積分吸光度值為34.563± 2.926)比較顯著降低(P＜0.05)。HF+SERCA2a組心肌細胞的SERCA2a表達(吸光度值為1.1758± 0.0387，積分吸光度值為38.684±3.358)較對照組顯著增高(P＜0.05)，也顯著高于HF組與HF+EGFP組(P＜0.05)。

Figure 4.SERCA2a diffusely expressed in myocardial tissues (SP，×200).A:control;B:HF;C:HF+EGFP; D:HF+SERCA2a.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs SERCA2a group.圖4 SERCA2a在心肌組織中的表達

6 心肌細胞凋亡改變

通過TUNEL試劑盒檢測發現，心肌細胞發生凋亡后，細胞核呈棕褐色，胞核呈橢圓形或圓形，胞漿淡染，在心肌組織內呈散在分布。非凋亡心肌細胞的細胞核被蘇木素染呈深藍色，細胞核呈長橢圓形或桿狀，見圖5。對照組比格犬的心肌細胞未見凋亡細胞。HF組及HF+EGPF組見散在的凋亡心肌細胞，凋亡指數分別為(4.56±0.29)%和(4.21± 0.31)%，均較對照組顯著增高。HF+SERCA2a組心肌細胞的凋亡指數為(1.47±0.13)%，較HF組和HF+EGFP組顯著降低(P＜0.01)。

7 心肌組織MMP-9免疫組織化學染色

MMP-9主要表達于心肌細胞的胞漿，呈棕黃色，散在分布或小片狀表達，見圖6。采用Leica Qwin圖像分析軟件對各組比格犬的心肌組織MMP-9表達進行半定量分析，計算20個高倍視野的吸光度和積分吸光度，發現HF組MMP-9(吸光度值為0.3147 ±0.0079，積分吸光度值為4.354±0.142)和HF+ EGFP組(吸光度值為0.3082±0.0075，積分吸光度值為4.276±0.139)顯著高于對照組(吸光度值為0.0346±0.0013，積分吸光度值為0.145±0.027) (P＜0.01)。HF+SERCA2a組心肌細胞的MMP-9表達(吸光度值為0.1365±0.0045，積分吸光度值為1.941±0.093)較對照組顯著增高(P＜0.05)，但較HF組、HF+EGFP組顯著降低(P＜0.05)。

Figure 5.Apoptotic index of the myocardial tissues(TUNEL，×200).A:control;B:HF;C:HF+EGFP;D:HF +SERCA2a.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs SERCA2a group.圖5 凋亡的心肌細胞

Figure 6.Expression of MMP-9 in myocardial tissues(SP，×400).A:control;B:HF;C:HF+EGFP;D:HF +SERCA2a.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs SERCA2a group.圖6 心肌組織MMP-9蛋白的表達

討論

左心室功能不全或心力衰竭時，心臟結構和功能發生進行性損害，均表現為心臟重構，組織學上可見心肌細胞凋亡、細胞外膠原沉積和基因/細胞因子活化的增加。多種因素可導致心臟重構，其基本過程表現為Ca2+穩態失衡，Ca2+信號通路激活，心肌細胞肥大和結構變化，Ca2+調節的改變是心力衰竭發展的必然通路［5］。有研究表明，靜息期Ca2+持久升高可激活絲/蘇氨酸磷酸化酶而誘導心肌肥厚，促進細胞凋亡。降低舒張期胞內Ca2+濃度不僅有益于收縮性，而且能減少磷酸化酶激活，阻斷細胞凋亡和心肌肥厚的發生［6］。過表達SERCA2a通過增加肌漿網攝取和Ca2+的釋放，降低舒張期胞內Ca2+濃度，成為減緩心室重構發生的重要途徑［7］。

本實驗結果發現，SERCA2a基因轉染30 d后，左室EF較HF組和HF+EGFP組顯著升高，LVDD 和LVSD較HF組和HF+EGFP組顯著下降，相關的血流動力學改變見前期實驗［8］，表明SERCA2a基因治療能改善心肌收縮，減緩心臟重構。

SERCA2a基因轉染后，經RT-PCR和免疫組化均發現，在HF+SERCA2a組，心肌的SERCA2a表達顯著高于HF組和HF+EGFP組，提示外源基因在心肌組織中獲得了表達。電鏡觀察HF組心肌纖維呈變性改變，肌絲片狀溶解、斷裂、排列紊亂、水腫，線粒體膨脹，呈氣球樣變，肌絲間的間隙增寬，肌漿網擴張，Z線融合，閏盤解離多見。SERCA2a基因轉染組心肌纖維完整，Z線清楚，線粒體結構完好、無腫脹，嵴突完好，閏盤結構清晰，說明SERCA2a基因治療能改善心肌病變程度。TUNEL法檢測發現，在HF組和HF+EGFP組，凋亡指數與對照組相比顯著增加(P＜0.05);而在SERCA2a基因治療30 d組，凋亡指數與HF組和HF+EGFP組相比顯著減少(P＜0.05)。提示SERCA2a轉染可能抑制心肌細胞凋亡。

鈣泵的活性除主要受SERCA2a表達程度影響外，還與一些調節因子的表達密切相關，其中PLN對SERCA功能調節作用最為重要。非磷酸化的PLN 與SERCA結合，通過蛋白-蛋白之間的相互作用，抑制鈣泵與Ca2+的親和力，降低ATP酶的活性;磷酸化的PLN與SERCA解離，減輕對SERCA的抑制，導致SERCA的Ca2+轉運速率增加。SERCA蛋白的活化程度則取決于PLN數量和磷酸化程度，PLN/ SERCA2a比值與心肌的收縮力呈負相關［9］。本實驗結果顯示，PLN mRNA表達水平在HF組、HF+EGFP組、HF+SERCA2a組及對照組之間無顯著差異，與Beeri等［10］和Jiang等［11］的報道一致。盡管PLN沒有發現顯著改變，但隨著SERCA2a水平升高，PLN/ SERCA2a比值下降，心肌收縮力提高。

心肌基質金屬蛋白酶活性改變與左室擴張、心室重構密切相關，特別是MMP-9在缺血和非缺血擴張心肌病大量增加，在心力衰竭引起的心室重構中的作用受到日益關注。本實驗結果發現，在快速起搏所致的心力衰竭組，心肌組織MMP-9表達顯著強于對照組，SERCA2a基因治療30 d組，MMP-9表達較心衰組明顯減弱，說明將SERCA2a基因在心肌局部過表達除改善心力衰竭癥狀外，還可通過減少MMP-9的表達，延緩心衰進程中心室重構的進展。

綜上所述，本實驗在大動物模型上，通過基因轉染，上調心肌細胞SERCA2a的表達，能夠改善心臟功能，抑制心室重塑，并對其發生機理進行了初步探討。SERCA2a基因轉導治療晚期心力衰竭的I、II期臨床試驗中取得了較好的效果［12-13］，進一步在大動物模型中探索有效的基因轉染方法，研究其改善心臟功能，減緩心室重構的機制，將為SERCA2a基因轉導治療晚期心力衰竭在臨床的早日應用提供理論基礎，為提高治療效果、減少臨床風險提供新的思路或方法。

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Transfection of rAAV1-SERCA2a improves cardiac function of beagles with heart failure

MI Ya-fei1，LI Xiao-ying2，JIANG Jian-jun1，FU Zhi-qing2，LU Xiao-chun2
(1Department of Cardiology，Taizhou Hospital，Wenzhou Medical University，Taizhou 317000，China;2First Department of Geriatric Cardiology，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China.E-mail:xyli301@163.com)

AIM:To study the effects of recombinant adeno-associated virus type 1(rAAV1)-sarcoplasmic/ endoplasmic reticulum calcium ATPase 2a(SERCA2a)transfection on the cardiac function of beagles with heart failure (HF).METHODS:The beagles were used to make an animal model with heart failure after rapid right ventricular pacing (230 beats/min)for 30 d.A reduced rate(180 beats/min)was continuously applied for another 30 d.The beagles were divided into 4 groups(n=4):control group，HF group，HF+EGFP group and HF+SERCA2a group.rAAV1-EGFP and rAAV1-SERCA2a(both 1×1012viral genomes)were intramyocardially injected into the animals in the latter 2 groups，respectively.RESULTS:After transfection for 30 d，the left ventricular systolic function in HF+SERCA2a group was similar to that in control group，and significantly higher than that in HF group(P＜0.05).The ratio of SERCA2a mRNA/ GAPDH mRNA was significantly higher in HF+SERCA2a group than that in HF group(P＜0.05).The expression level of SERCA2a in the myocardial tissues was higher in HF+SERCA2a group than that in HF group(P＜0.05).The apoptotic index of the cardiomyocytes and the protein expression of MMP-9 were much lower in HF+SERCA2a group than those in HF group(P＜0.05).No significant difference of all parameters was observed between HF group and HF+EGFP group.The mRNA level of phospholamban was unchanged.CONCLUSION:Transfection of SERCA2a improves the expression of SERCA2a，restores the cardiac function and inhibits left ventricular remodeling by reducing the cardiac cell apoptosis and the MMP-9 expression in the heart failure beagles.

Heart failure;Rapid right ventricular pacing;Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 2a;Adeno-associated virus

R541.61

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.003

1000-4718(2014)02-0208-06

2013-07-24

2013-12-23

國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)(No.2006CB503806)

△通訊作者Tel:010-66876231;E-mail:xyli301@163.com