MR-1通過抑制PERK/Nrf2途徑減輕缺氧/復氧誘導的心肌細胞凋亡*

陶天琪，王曉礽，徐菲菲，劉蜜，李玉珍，劉秀華

(中國人民解放軍總醫院病理生理研究室，北京 100853)

·論著·

MR-1通過抑制PERK/Nrf2途徑減輕缺氧/復氧誘導的心肌細胞凋亡*

陶天琪，王曉礽，徐菲菲，劉蜜，李玉珍，劉秀華△

(中國人民解放軍總醫院病理生理研究室，北京 100853)

目的:研究肌原纖維形成調節因子1(MR-1)是否通過抑制蛋白激酶R樣內質網激酶(PERK)/核因子E2相關因子2(Nrf2)途徑減輕缺氧/復氧(H/R)誘導的心肌細胞凋亡。方法：在原代培養的乳大鼠心肌細胞H/R模型上，采用Annexin V/PI雙標法檢測心肌細胞的凋亡率;以Western blotting檢測葡萄糖調節蛋白78 (GRP78)、磷酸化PERK、Nrf2、活化轉錄因子4(ATF4)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、Bcl-2和Bax的蛋白水平，研究過表達或敲低對于H/R致心肌細胞凋亡的影響及其與PERK/Nrf2途徑活化的關系。結果:H/R引起心肌細胞凋亡;過表達MR-1減輕H/R引起的細胞凋亡(P＜0.01)，下調CHOP表達(P＜0.05)，引起Bcl-2/Bax值升高(P＜0.01)，并抑制H/R誘導的PERK磷酸化、Nrf2核轉位和ATF4表達(P＜0.01)。敲低MR-1加重H/R引起的細胞凋亡(P＜0.01)、CHOP表達上調(P＜0.05)和Bcl-2/Bax值下降(P＜0.01)，并加重H/R誘導的PERK磷酸化(P＜0.05)、Nrf2核轉位和ATF4表達(P＜0.01)。結論:MR-1通過抑制PERK/Nrf2途徑而減輕缺氧/復氧誘導的心肌細胞凋亡。

細胞凋亡;缺氧/復氧;心肌細胞;肌原纖維形成調節因子1;蛋白激酶R樣內質激酶;核因子E2相關因子2

缺血性疾病是嚴重危害人類健康的常見病［6］，盡早恢復組織血供是防治缺血損傷最有效的措施。但缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷所致的心肌細胞凋亡、壞死、惡性心律失常和心功能障礙嚴重影響再灌注療法療效和患者預后，是心血管領域亟待解決的重大問題。其中再灌注損傷誘導的心肌細胞凋亡是造成心肌梗死面積擴展、心功能障礙的重要因素，闡明調控心肌細胞凋亡的機制將為缺血再灌注的防治提供新靶點［1］。肌原纖維形成調節因子1(myofibrillogenesis regulator 1，MR-1)是課題組從人類骨骼肌cDNA文庫克隆出的人類新功能基因(AF417001)，定位于人類染色體2q35，mRNA全長755 bp，編碼一段142個氨基酸組成的蛋白質，在心肌、骨骼肌、腎臟和肝臟中高表達［2-4］。課題組前期工作證實，MR-1定位于心肌細胞漿的肌原纖維，缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)時心肌細胞MR-1表達下調;過表達MR-1明顯減輕H/R導致的腎小管上皮細胞凋亡，提示MR-1具有抗細胞凋亡的作用，其機制尚待闡明。

內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是細胞應激的最初反應，可以整合并啟動線粒體和細胞核反應，過度內質網應激誘導細胞凋亡主要通過蛋白激酶R樣內質網激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)介導的C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)途徑、肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)介導的caspase-12［5］和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)［6］途徑所介導。其中PERK通過激活真核細胞起始因子2(eukaryotic initiator factor 2α，eIF2α)上調活化轉錄因子4(activating transcription factor 4，ATF4)，增加CHOP的表達，導致抑凋亡因子Bcl-2蛋白下調和促凋亡因子Bax蛋白上調，引起細胞凋亡［7］。我們既往的工作證實H/R誘導心肌細胞發生嚴重的ERS反應，表現為內質網應激分子葡萄糖調節蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)和PERK表達上調，ERS相關細胞凋亡分子CHOP及其下游分子Bcl-2表達下調，Bax表達上調［8-9］，提示PERK途徑是介導H/R誘導心肌細胞凋亡的重要信號途徑。核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)在生理狀態下位于細胞漿內的細胞骨架。既往研究證實I/R誘導Nrf2胞核轉位，與抗氧化反應元件(antioxidant response elements，AREs)相關靶基因的啟動子結合，促使抗氧化蛋白及酶類如NAD(P)H的基因轉錄增加，減輕氧化反應［10］。最近發現，Nrf2還是PERK的下游底物［6］，I/R誘導核轉位的Nrf2在細胞核內大量聚集［10］，通過作用于ATF4啟動子，上調ATF4的轉錄水平［11］，從而正反饋調節PERK途徑凋亡相關分子ATF4，提示PERK介導的Nrf2/ATF4相關信號途徑可能是I/R誘導細胞凋亡的重要機制。本工作以體外培養的乳大鼠心肌細胞缺氧8 h/復氧16 h模型模擬在體心肌I/R誘導心肌細胞凋亡，分別以腺病毒感染過表達和穩定型小干擾RNA(stealth siRNA，st-RNA)轉染技術敲低MR-1表達，研究其對H/ R誘導的心肌細胞凋亡和PERK介導的Nrf2/ATF4信號途徑的影響，旨在證實MR-1通過抑制PERK介導的Nrf2/ATF4相關信號途徑減輕H/R導致的心肌細胞細胞凋亡，為心肌I/R的防治提供新途徑。

材料和方法

1 動物與試劑

清潔級SD乳鼠(出生24 h內)購自北京市軍事醫學科學院實驗動物中心;DMEM培養基購自Gibco;新生牛血清購自杭州四季青生物工程材料研究所;胰蛋白酶、蛋白酶抑制劑和Triton X-100購自Sigma;Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-FITC Apoptosis Direction Kit)購自南京凱基生物工程公司;蛋白電泳分子量(7～175 kD)標記為Bio-Rad產品;蛋白定量試劑盒購自康威世紀公司;脂質體Lipofectamine 2000購自Invitrogen;兔抗人GRP78、PERK、Bcl-2、Bax多克隆抗體、兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)單克隆抗體和小鼠抗人CHOP單克隆抗體購自Cell Signaling Technology;兔抗人磷酸化PERK(p-PERK)、ATF4和Nrf2多克隆抗體，Texas red-conjugated驢抗兔抗體，增強化學發光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒購自Santa Cruz;辣根過氧化酶標記山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG購自Epitomics;胞漿胞核蛋白分離提取試劑盒購自Thermo Fisher Scientific;含DAPI的抗淬滅封片劑購自Vector Laboratories;牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)購自Merck;其余化學試劑為國產分析純產品。

2 乳鼠心肌細胞培養與分組

按我們報道的方法［12］培養乳鼠心肌細胞:出生24 h內乳大鼠常規消毒后無菌操作取出心尖部組織，立即在4℃無菌磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffered saline，PBS)中洗去殘血，分離附著組織后，剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小碎塊，經0.15%胰蛋白酶37℃反復消化，制備心肌細胞懸液，用含10%新生牛血清的DMEM培養基稀釋成細胞密度為3×109/L，接種于75 mm2培養瓶中，置37℃、5% CO2孵箱中進行原代培養。實驗前24 h更換無血清DMEM培養基，進行同步化處理后，隨機分為以下7 組:(1)正常對照組(control):正常連續培養48 h; (2)缺氧/復氧組(H/R):心肌細胞置于三氣培養箱缺氧8 h(37℃，O2含量5%，N2含量90%，CO2含量5%)，后置于37℃、5%CO2培養箱復氧培養16 h結束實驗;(3)MR-1過表達組(Ad-MR-1):以構建的MR-1重組腺病毒Ad-MR-1感染細胞，使感染復數(multiplicity of infection，MOI;即:加入病毒總數/細胞總數)為50 pfu，感染48 h后結束實驗;(4) MR-1敲低組(st-MR-1):針對rat MR-1(NM_ 001134753.1)設計并篩選出25 bp的st-RNA，以50 nmol/L轉染細胞，轉染方法見下述，轉染5 h后更換有血清DMEM培養液;(5)MR-1過表達+缺氧/復氧組(Ad-MR-1+H/R):按照(3)組方法以Ad-MR-1感染細胞20 h后更換無血清DMEM，再按照(2)組程序操作;(6)MR-1敲低+缺氧/復氧組(st-MR-1 +H/R):按照(4)組方法轉染st-MR-1，轉染后20 h更換無血清DMEM，再按照(2)組程序操作;(7)隨機25 bp雙鏈RNA轉染對照組(mock):隨機合成25 bp且GC含量與st-MR-1一致的雙鏈st-RNA，按照(4)組方法轉染操作。

3 腺病毒的包裝與感染

按照文獻報道方法從質粒pcDNA3.1-hMR-1［13］中擴增目的基因MR-1，委托Invitrogen公司構建包裝含有MR-1全長的重組腺病毒Ad-MR-1，結果測定病毒滴度為3.3×1012pfu/L。以該病毒原液感染生長至對數期的細胞，感染前更換有血清的DMEM培養液，每1×105個細胞約加入病毒液10 μL，使感染復數約為50 pfu，感染48 h后結束實驗。

4 st-RNA的構建與轉染

針對rat MR-1(NM_001134753.1)設計并篩選出25bp的st-RNA(st-MR-1)，序列為5’-CGACAGCUAACAAGGCUUCCCAGAA-3’，以50 nmol/L轉染細胞，轉染方法參照Lipofectamin 2000試劑盒說明書進行，轉染5 h后更換有血清DMEM培養液15 h后更換無血清DMEM培養液。

5 Annexin V/PI雙標法檢測細胞凋亡

培養的乳大鼠心肌細胞以1×104/cm2的密度接種于25 mm2培養皿，參照Annexin V-FITC Apoptosis Direction Kit說明書的方法進行檢測:實驗處理結束后以含EDTA的0.25%胰酶消化并收集細胞，以0.01 mol/L PBS離心洗滌細胞2次(3 000 r/min離心30 s)，洗滌后的沉淀以500 μL Binding Buffer懸浮均勻，分別加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，充分混合均勻，室溫下避光孵育10 min后，流式細胞術檢測早期凋亡率和晚期凋亡率之和。

6 Nrf2細胞熒光染色

細胞以1×104/cm2的密度接種于包被有明膠的蓋玻片，實驗處理后以PBS洗滌3次，-20℃預冷的冰甲醇預固定5 min，4%多聚甲醛固定15 min，以含有0.1%Triton X-100、含1%BSA的PBS在室溫下封閉50 min，以1%BSA配制Ⅰ抗工作液:多克隆兔抗人Nrf2(1∶40)，室溫下Ⅰ抗工作液孵育1 h，PBS洗滌10 min×3次，以PBS配制Ⅱ抗工作液: Texas red-conjugated驢抗兔(1∶200)。Ⅱ抗工作液于室溫下避光孵育1 h，以PBS洗滌10 min×3次，用含DAPI的抗淬滅封片劑封片，激光掃描共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM-510 Meta)觀察并采集圖像。

7 Nrf2胞漿胞核蛋白分離與蛋白定量

按照胞漿胞核蛋白分離提取試劑盒的操作步驟進行，以BCA法進行蛋白定量。

8 免疫印跡法

取含有80 μg蛋白進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后以半干式法電轉至硝酸纖維素膜上，0.01mol/L TBST(20 mmol/L Tris-HCl，137 mmol/L NaCl，0.01%Tween-20，pH 7.5)配制的5%BSA室溫封閉，加入Ⅰ抗于4℃過夜雜交，不同抗體的稀釋度分別為:anti Bcl-2(1∶1 000)，anti Bax(1∶1 000)，anti CHOP(1∶500)，anti ATF4(1∶200)，anti Nrf2 (1∶100)，antip-PERK(1∶500)，antiPERK (1∶1 000)，anti GRP78(1∶500)，anti GAPDH (1∶1 000);加入辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗(TBST配制，1∶1 000)，室溫作用2 h后以ECL試劑盒發光顯影。以圖像分析軟件Image-Pro Plus測量各組條帶積分吸光度(integrated absorbance，IA;IA=mean absorbance×area)進行半定量分析，并與內參照GAPDH的IA值進行比較。

9 統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件分析，數據用均數±標準差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析(Oneway ANOVA)進行組間比較，采用q檢驗進行兩兩比較;對胞核Nrf2蛋白量與ATF4蛋白量進行相關分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 MR-1減輕H/R誘導的心肌細胞凋亡

流式細胞術檢測細胞凋亡率的結果見圖1。缺氧8 h/復氧16 h(H/R組)心肌細胞凋亡率較正常對照組高［(12.1±2.2)%vs(6.3±1.1)%，P＜0.01］。與正常對照組比較，重組腺病毒Ad-MR-1感染心肌細胞48 h致MR-1過表達的Ad-MR-1組細胞凋亡率無明顯改變(P＞0.05);但MR-1過表達明顯抑制心肌細胞H/R誘導的心肌細胞凋亡增加［(9.1 ±1.5)%vs(12.1±2.2)%，P＜0.01］。以st-RNA敲低MR-1表達后誘導心肌細胞凋亡［(15.9± 2.1)%vs(12.0±1.1)%，P＜0.01］;與單純H/R組比較，MR-1敲低加重H/R誘導的心肌細胞凋亡［(17.2±0.8)%vs(12.1±2.2)%，P＜0.01］。上述結果提示MR-1具有抑制H/R誘導心肌細胞凋亡的作用。

Figure 1.Myofibrillogenesis regulator 1(MR-1)reduced apoptosis induced by hypoxia/reoxygenation(H/R)in vitro as determined by flow cytometric analysis of Annexin V and propidium iodide(PI)double-stained cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R;＆P＜0.05 vs mock.圖1 Annexin V/PI雙染的流式細胞術分析MR-1對H/R誘導心肌細胞凋亡的影響

2 MR-1減輕H/R誘導的內質網應激及其相關細胞凋亡

Western blotting檢測心肌細胞內質網應激相關分子GRP78的結果見圖2。與正常對照組比較，H/ R組GRP78蛋白表達高1.1倍(P＜0.01)，提示H/R可誘導心肌細胞產生內質網應激。Ad-MR-1組GRP78蛋白表達較正常對照組高1倍(P＜0.01)，與H/R組無顯著差異(P＞0.05)，但是MR-1過表達減輕了H/R誘導的內質網應激分子GRP78蛋白表達，表現為Ad-MR-1+H/R組GRP78蛋白表達較H/R組低14.2%(P＜0.01)，提示單純過表達MR-1可產生內質網應激反應，而MR-1過表達減輕了H/R誘導的內質網應激反應。Mock組GRP78蛋白表達較正常對照組高61.7%(P＜0.01)，而敲低MR-1(st-MR-1 組)GRP78蛋白表達較Mock組高21.2%(P＜0.01);敲低MR-1的心肌細胞在H/R后(st-MR-1+H/R組) GRP78蛋白表達較H/R組高5.6%(P＜0.05)，提示敲低MR-1本身可以誘導內質網應激反應，并進一步加重H/R誘導的內質網應激反應。

Figure 2.Myofibrillogenesis regulator 1(MR-1)reduced the expression of GRP78 in H/R-treated cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R;＆P＜0.05 vs mock.圖2 MR-1對H/R心肌細胞GRP78蛋白表達的影響

內質網應激相關細胞凋亡分子CHOP表達的檢測結果見圖3。與正常對照組比較，H/R組CHOP蛋白表達高16.0%(P＜0.01)，提示H/R可誘導內質網應激相關細胞凋亡;單純過表達MR-1對CHOP蛋白表達無明顯影響(P＞0.05)，但是過表達MR-1卻減少H/R誘導的CHOP蛋白表達，表現為CHOP蛋白表達較H/R組低9.9%(P＜0.05)，提示MR-1過表達明顯抑制H/R誘導的內質網應激相關細胞凋亡。Mock組心肌細胞CHOP蛋白表達較正常對照組高14.2%(P＜0.01);與mock組比較，st-MR-1組心肌細胞CHOP蛋白表達高8.6%(P＜0.01);敲低MR-1的心肌細胞行H/R后CHOP蛋白表達較H/R組高5.1%(P＜0.05)，提示敲低MR-1本身可以誘導內質網應激相關的細胞凋亡，并進一步加重H/R誘導的內質網應激相關的細胞凋亡。

Figure 3.Effect of myofibrillogenesis regulator 1(MR-1)on the expression of ERS-related apoptotic protein CHOP in H/R-treated cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R;＆P＜0.05 vs mock.圖3 MR-1對H/R心肌細胞CHOP蛋白表達的影響

進一步分析CHOP下游促凋亡因子Bax蛋白和抗凋亡因子Bcl-2蛋白表達的結果見圖4。與正常對照組比較，H/R組抑凋亡因子Bcl-2蛋白表達低20.6%，促凋亡因子Bax蛋白表達高18.9%，Bcl-2/ Bax值低33.2%(P＜0.01)，提示H/R誘導心肌細胞內質網應激相關細胞凋亡的CHOP途徑活化。單純過表達MR-1的Ad-MR-1組Bcl-2和Bax蛋白表達無顯著差異(P＞0.05)，但卻明顯影響H/R誘導的CHOP下游促凋亡因子Bax蛋白和抗凋亡因子Bcl-2蛋白表達。與H/R組比較，Ad-MR-1+H/R組Bcl-2蛋白表達高29.3%，Bax蛋白表達低15.9%，Bcl-2/Bax值高53.7%(P＜0.01)，提示MR-1過表達可以減輕H/R誘導的CHOP凋亡途徑活化。與正常對照組比較，mock組Bcl-2和Bax蛋白表達分別高23.4%和20.8%，Bcl-2/Bax值低15.2%(P＜0.01)，st-MR-1組Bcl-2和Bax蛋白表達較mock組分別低41.0%和18.8%(P＜0.05)，但Bcl-2/Bax值低27.3%(P＜0.01);敲低MR-1進一步加重H/ R誘導的Bcl-2下調和Bax上調，表現為與H/R組比較，st-MR-1+H/R組心肌細胞Bcl-2蛋白表達降低25.4%，Bax蛋白表達增高26.2%，Bcl-2/Bax值降低28.8%(P＜0.01)，提示敲低MR-1本身可以誘導CHOP凋亡途徑活化，并進一步加重H/R誘導的CHOP凋亡途徑活化。

Figure 4.Effect of myofibrillogenesis regulator 1(MR-1)on the expression of anti-apoptotic protein Bcl-2 and proapoptotic protein Bax，and Bcl-2/Bax ratio in H/R-induced cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R;＆P＜0.05 vs mock.圖4 MR-1對H/R心肌細胞Bcl-2和Bax蛋白表達及Bcl-2/Bax值的影響

3 MR-1通過PERK/Nrf2途徑減輕內質網應激相關細胞凋亡

3.1 MR-1抑制H/R誘導的PERK磷酸化Western blotting檢測心肌細胞PERK表達與磷酸化的結果見圖5。H/R明顯上調PERK表達及其磷酸化，其PERK蛋白表達和磷酸化水平分別較正常對照組高24.6%和100%(P＜0.01)，提示H/R上調PERK蛋白表達和磷酸化，其中磷酸化上調更為明顯。單純過表達MR-1的Ad-MR-1組PERK蛋白表達和磷酸化水平較正常對照組無顯著差異(P＞0.05);而過表達MR-1后行H/R的心肌細胞，盡管其PERK蛋白表達較H/R組高18.5%(P＜0.05)，卻明顯下調PERK磷酸化水平，其PERK磷酸化水平較H/R組低56.5%(P＜0.01)，提示單純過表達MR-1對PERK的蛋白表達和磷酸化無明顯影響，但明顯抑制H/R誘導的PERK磷酸化上調。與正常對照組比較，mock組PERK蛋白表達無顯著差異(P＞0.05)，但其磷酸化水平高22.1%(P＜0.01);與mock組比較，單純敲低MR-1的st-MR-1組PERK蛋白表達和磷酸化水平分別高17.7%和35.0%(P＜0.01)，而與H/R組比較，敲低MR-1的心肌細胞在H/R后其PERK蛋白表達無明顯改變(P＞0.05)，但PERK磷酸化水平高2.5%(P＜0.05)，提示敲低MR-1本身可以誘導PERK磷酸化，并進一步上調H/R誘導的PERK磷酸化。

Figure 5.Myofibrillogenesis regulator 1(MR-1)reduced the phosphorylation of PERK in H/R-treated cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R;＆P＜0.05 vs mock.圖5 MR-1對H/R心肌細胞PERK磷酸化的影響

3.2 MR-1抑制H/R誘導的Nrf2核轉位采用細胞免疫熒光染色檢測PERK下游分子Nrf2亞細胞分布的結果見圖6A。正常對照組Nrf2蛋白主要均勻分布于胞漿，胞核內少量均勻分布。與正常對照組比較，H/R組心肌細胞內Nrf2出現明顯的核轉位現象，Nrf2主要集聚在細胞核內和核周，且在核內呈團塊狀分布;單純過表達MR-1對Nrf2亞細胞分布無明顯影響，表現為Ad-MR-1組Nrf2在心肌細胞胞漿內均勻分布，少量均勻分布在核內，與正常對照組類似;但過表達MR-1明顯減輕H/R誘導的心肌細胞Nrf2核轉位，表現為Ad-MR-1+H/R組心肌細胞內Nrf2均勻分布于胞漿，少量Nrf2均勻分布于核內;與正常對照組比較，mock組Nrf2在胞漿和胞核內均勻分布，但在少數細胞的核內呈團塊狀分布;與mock組比較，敲低MR-1后心肌細胞Nrf2集中分布在核內和核周，提示敲低MR-1可以造成Nrf2核轉位，且敲低MR-1進一步加重H/R誘導的心肌細胞Nrf2核轉位，表現為st-MR-1+H/R組心肌細胞內Nrf2團塊狀積聚于胞核內和核周，極少量分布于胞漿。上述結果表明，H/R造成Nrf2核轉位，過表達MR-1明顯減輕H/R誘導的Nrf2核轉位，敲低MR-1加重H/R誘導的心肌細胞Nrf2核轉位。

Western blotting檢測Nrf2胞漿與胞核組分蛋白的結果見圖6B、C。正常對照組心肌細胞胞漿和胞核中均存在Nrf2蛋白。H/R組Nrf2胞核組分蛋白較正常對照組高47.9%(P＜0.01)，胞漿組分蛋白無明顯改變(P＞0.05)，提示H/R增加Nrf2蛋白的表達并誘導其核轉位。單純過表達MR-1對心肌細胞Nrf2胞核組分蛋白無明顯影響(P＞0.05)，但胞漿組分蛋白較正常對照組高32.5%(P＜0.01);與H/R組比較，過表達MR-1后行H/R的心肌細胞，盡管其胞漿組分蛋白較H/R組高1.2倍，但是明顯減少了H/R誘導的Nrf2胞核組分蛋白上調，其Nrf2胞核組分蛋白較H/R低30.6%(P＜0.01)，提示過表達MR-1增加Nrf2蛋白在胞漿的分布，但抑制H/R誘導的Nrf2核轉位。與正常對照組比較，mock組的Nrf2胞核和胞漿組分均升高，表現為胞核組分蛋白高31.4%，胞漿組分蛋白高25.7%(P＜0.01);與mock組比較，敲低MR-1僅引起Nrf2胞核組分蛋白上調，表現為Nrf2胞核組分蛋白高18.5%(P＜0.01)，胞漿組分無顯著差異(P＞0.05);敲低MR-1進一步加重H/R誘導的心肌細胞Nrf2胞核組分蛋白上調，表現為st-MR-1+H/R組心肌細胞核Nrf2蛋白較H/R組高36.1%(P＜0.01)，但對胞漿組分無明顯影響(P＞0.05)，提示敲低MR-1進一步上調H/R誘導的Nrf2胞核組分蛋白，加重H/R誘導的Nrf2核轉位。

3.3 MR-1抑制H/R誘導的Nrf2下游分子ATF4表達上調Western blotting檢測Nrf2的下游分子ATF4表達的結果見圖7。與正常對照組比較，H/R 組ATF4蛋白表達高51.6%(P＜0.01)，提示H/R可通過激活PERK途徑導致心肌細胞內質網應激相關凋亡。過表達MR-1對ATF4蛋白表達無明顯影響(P＞0.05)，卻明顯抑制H/R誘導的ATF4蛋白表達，表現為Ad-MR-1+H/R組ATF4蛋白表達較H/R組低17.7%(P＜0.01)，提示MR-1過表達通過抑制PERK途徑的激活減輕H/R誘導的內質網應激相關細胞凋亡。Mock組的ATF4蛋白表達較正常對照組高19.9%(P＜0.01)，但st-MR-1組ATF4蛋白表達較mock組高42.4%(P＜0.01);敲低MR-1可加重H/R誘導的ATF4蛋白表達，表現為st-MR-1 +H/R組較H/R組高27.4%(P＜0.05)，提示敲低MR-1本身可以激活PERK途徑誘導內質網應激相關細胞凋亡，并通過進一步激活PERK途徑加重H/ R誘導的內質網應激相關細胞凋亡。

Figure 6.Myofibrillogenesis regulator 1(MR-1)reduced the nuclear translocation of Nrf2 in H/R-treated cardiomyocytes.A:Nrf2 immunofluorescence assay and DAPI staining under laser scanning confocal microscope (×600);B，C:the levels of nuclear Nrf2 protein and cytoplasmic Nrf2 protein examined by Western blotting.GAPDH was used as a normalization control.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R;＆P＜0.05 vs mock.圖6 MR-1對H/R心肌細胞Nrf2蛋白核轉位的影響

Figure 7.Effect of myofibrillogenesis regulator 1(MR-1)on the expression of ATF4 in H/R-treated cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R;＆P＜0.05 vs mock.圖7 MR-1對H/R心肌細胞ATF4蛋白表達的影響

3.4 Nrf2胞核組分蛋白與ATF4蛋白表達的相關分析相關分析顯示，Nrf2胞核組分蛋白與ATF4蛋白表達呈顯著正相關(r=0.935，P＜0.01)。

討論

I/R損傷指缺血一定時間的心肌恢復灌流后，組織損傷反而進行性加重，心肌細胞從可逆損傷轉變為不可逆損傷的現象。心肌細胞凋亡和壞死是心肌再灌注損傷的特征之一［14］。減輕心肌細胞凋亡是減輕心肌細胞I/R損傷的關鍵途徑。心肌細胞H/R可在一定程度上模擬心肌缺血再灌注損傷，研究證實H/R可誘導心肌細胞凋亡［8-9］。MR-1是一種從人類骨骼肌cDNA文庫克隆出的新功能基因，在心肌、骨骼肌、腎臟和肝臟中高表達［2-4］。本研究首次證實了MR-1通過減輕PERK磷酸化降低H/R誘導的心肌細胞凋亡，對H/R的心肌細胞具有保護作用。

前期工作證實，過表達MR-1明顯減輕H/R誘導的腎小管上皮細胞凋亡，提示MR-1可能具有抗細胞凋亡的作用。本研究在新生SD乳鼠心肌細胞H/ R模型上，采用Annexin V/PI雙染結合流式細胞術的方法，證實了H/R誘導心肌細胞凋亡，表現為H/ R組細胞凋亡率較正常對照組高，與文獻報道一致［15］。MR-1在心肌細胞中有生理性表達［2-4］，定位于心肌細胞漿的肌原纖維，H/R時心肌細胞MR-1表達下調。本研究證實MR-1減輕H/R誘導的心肌細胞凋亡。我們以缺氧8 h/復氧16 h處理心肌細胞模擬在體的心肌I/R損傷，發現H/R誘導體外培養的心肌細胞凋亡。我們以含有MR-1全長的重組腺病毒感染心肌細胞，發現過表達MR-1對細胞凋亡率較正常對照組無明顯改變，但MR-1過表達明顯抑制H/R誘導的心肌細胞凋亡。相反，以st-RNA轉染心肌細胞以抑制MR-1的表達，發現敲低MR-1可引起心肌細胞凋亡率的升高，且敲低MR-1加重H/R誘導的心肌細胞凋亡率。

H/R所致的心肌細胞凋亡機制尚未完全闡明。近年來，ERS相關細胞凋亡在心肌細胞凋亡的發病機制中的作用越來越受到重視。ERS是細胞對內外刺激的適應性反應。適度ERS誘導GRP78等內質網伴侶分子表達上調，有利于內質網處理未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白，并促進鈣穩態的恢復;持續而嚴重的ERS可明顯上調GRP78的表達，誘導ERS相關的促凋亡因子CHOP的表達及活化，觸發ERS相關凋亡途徑［6］。CHOP是過度ERS誘導細胞凋亡的關鍵分子，可直接下調Bcl-2的表達，導致Bax從胞漿轉位至線粒體，促進細胞凋亡［16］。Bax和Bcl-2通過形成同源或異源二聚體來調節細胞凋亡。Bax形成同源二聚體時誘導細胞凋亡，Bax與Bcl-2形成異源二聚體時抑制細胞凋亡［17］。Bcl-2與Bax蛋白量的比率決定異二聚體(Bcl-2/Bax)與同二聚體(Bax/ Bax)的比值，故細胞凋亡的發生取決于Bcl-2和Bax的相對濃度，即Bcl-2/Bax值［18］。在正常培養的心肌細胞中，GRP78、CHOP、Bcl-2和Bax均有生理性表達，我們以H/R處理心肌細胞，發現H/R誘導心肌細胞產生ERS相關的細胞凋亡，GRP78、CHOP和Bax表達均高于正常對照組，Bcl-2表達和Bcl-2/Bax值則均低于正常對照組。過表達MR-1可引起適度ERS，但沒有引起ERS相關細胞凋亡，表現為GRP78表達較正常對照組高，但對細胞凋亡率及凋亡相關分子的表達無明顯影響;過表達MR-1明顯減輕H/R誘導的ERS相關心肌細胞凋亡，表現為較H/R組GRP78、CHOP和Bax蛋白表達更低，Bcl-2蛋白表達更高，Bcl-2/Bax值更高;敲低MR-1可產生ERS相關心肌細胞凋亡，表現為較mock組GRP78和CHOP蛋白表達高，Bcl-2/Bax值低;且MR-1敲低后H/R較單純H/R誘導的ERS相關細胞凋亡更為嚴重，表現為較H/R組GRP78、CHOP和Bax蛋白表達更高，Bcl-2蛋白表達更低，Bcl-2/Bax比值更低。上述結果提示，MR-1可能作為一個重要的內源性保護分子，在減輕H/R誘導的心肌細胞ERS相關凋亡中發揮重要作用。

PERK是介導ERS相關細胞凋亡的重要感受分子。生理狀態下，PERK與內質網相關分子GRP78結合，以無活性復合物的形式存在［19］。未折疊蛋白增多時，GRP78與未折疊蛋白結合而與PERK解離。解離后的PERK發生自身磷酸化而被激活，進一步磷酸化其下游底物eIF2α，選擇性上調ATF4。長期過度內質網應激時，ATF4上調CHOP的轉錄，導致ERS相關細胞凋亡［20］。我們前期研究結果顯示，與正常對照組比較，H/R誘導的PERK磷酸化水平、PERK下游信號分子ATF4和CHOP的表達更高，提示H/R誘導PERK介導的ERS相關細胞凋亡［8-9］。Nrf2生理狀態時位于細胞漿內的細胞骨架，與其抑制蛋白Keap1結合，處于非游離、非活性狀態。當I/ R誘導Nrf2發生核轉位，作用于AREs的相關序列，激活相關靶基因，繼而啟動下游抗氧化蛋白及酶類的基因轉錄，提高細胞抗氧化應激能力［10］。近期研究證實Nrf2是位于PERK下游的重要轉錄因子，PERK磷酸化激活Nrf2發生核轉位［6］，Nrf2的胞核組分蛋白可能作用于ATF4啟動子，上調ATF4的轉錄水平［11］，并進一步上調CHOP的轉錄，導致ERS相關細胞凋亡［20］。根據文獻報道，將人視網膜色素上皮細胞敲低Nrf2后行缺氧處理，ATF4的表達較缺氧組明顯降低。染色質免疫共沉淀結果顯示Nrf2作用于ATF4啟動子，且過表達Nrf2激活ATF4啟動子，促進ATF4的轉錄［11］。此外，敲低內皮細胞的Nrf2后行氧化磷脂處理，亦可顯著降低ATF4表達［21］。根據文獻推斷，細胞凋亡可通過內外因素激活PERK/Nrf2核轉位/ATF4/CHOP途徑發生。

本研究證實，在正常培養的心肌細胞中，Nrf2存在于胞核和胞漿內，但以胞漿內分布為主，PERK、ATF4和CHOP均有生理性表達。我們以H/R處理心肌細胞，發現H/R誘導心肌細胞PERK磷酸化，引起Nrf2核轉位，上調ATF4的表達，進而上調CHOP的表達。同時，雖然過表達MR-1對PERK途徑無明顯影響，表現為PERK磷酸化及下游信號分子的蛋白表達無明顯變化，但是過表達MR-1后行H/R處理，可下調H/R誘導的心肌細胞PERK磷酸化，減少Nrf2核轉位，下調ATF4和CHOP的蛋白表達，提示過表達MR-1可通過減輕H/R對PERK途徑的激活，減輕H/R誘導的ERS相關細胞凋亡。此外，敲低MR-1可誘導PERK磷酸化介導的ERS相關細胞凋亡，表現為PERK磷酸化高于MOCK組，Nrf2核轉位較mock組更明顯，ATF4和CHOP蛋白表達較mock組高;敲低MR-1后行H/R處理可通過進一步激活H/R誘導的PERK途徑，進而加重H/R誘導的ERS相關細胞凋亡，表現為PERK磷酸化較H/R組高，Nrf2核轉位較H/R組更明顯，ATF4和CHOP蛋白表達較H/R組高。在此基礎上對ATF4蛋白表達和胞核Nrf2蛋白之間進行相關分析發現，ATF4蛋白表達與Nrf2胞核組分蛋白呈正相關，提示Nrf2核轉位介導的凋亡信號途徑可能通過促進ATF4蛋白表達引起細胞凋亡。

另有文獻報道，轉錄因子Nrf2和ATF4具有相似的靶基因，存在協同和拮抗作用。兩者可直接誘導AREs相關基因的轉錄［22］，但也可直接作用于CHOP啟動子，ATF4促進CHOP轉錄，Nrf2抑制CHOP轉錄［23］。此外，Nrf2也可通過解除ATF4與CHOP的結合，進而抑制CHOP轉錄［24］。根據研究結果推斷，我們認為在H/R引起心肌細胞PERK介導的ERS相關細胞凋亡的過程中，Nrf2發生核轉位，促進ATF4的表達。雖然Nrf2可直接或間接下調CHOP的轉錄，但是ATF4上調促進CHOP的表達增加起主要作用。這提示H/R通過PERK介導的Nrf2核轉位/ATF4/CHOP途徑誘導心肌細胞凋亡，而MR-1通過抑制上述途徑減輕H/R誘導的心肌細胞凋亡。

綜上所述，我們認為MR-1通過抑制過度ERS發揮減輕心肌H/R損傷的作用，表現為降低H/R誘導的GRP78蛋白表達，抑制PERK介導的Nrf2核轉位/ATF4/CHOP途徑，減輕H/R誘導的ERS相關細胞凋亡。但MR-1對在體大鼠心肌I/R損傷的心肌保護作用尚待進一步研究。

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Myofibrillogenesis regulator 1 attenuates hypoxia/reoxygenation-induced apoptosis of cardiomyocytes by inhibiting PERK/Nrf2 pathway

TAO Tian-qi，WANG Xiao-reng，XU Fei-fei，LIU Mi，LI Yu-zhen，LIU Xiu-hua
(Department of Pathophysiology，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China.E-mail:xiuhualiu98@163.com)

AIM:To investigate the effect of myofibrillogenesis regulator 1(MR-1)on hypoxia/reoxygenation (H/R)-induced apoptosis of cardiomyocytes and to study the role of protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase (PERK)/nuclear factor E2-related factor 2(Nrf2)pathway.METHODS:In the H/R model of primarily cultured neonatal rat cardiomyocytes，the apoptosis was assessed by Annexin V/PI double staining.Western blotting was used to detect the protein levels of glucose-regulated protein 78(GRP78)，phosphorylated PERK，Nrf2，activating transcription factor 4 (ATF4)，C/EBP homologous protein(CHOP)，Bcl-2 and Bax.The effects of over-expression or knockdown of MR-1 on the apoptosis and the PERK/Nrf2 pathway were determined.RESULTS:H/R induced the apoptosis of cardiomyocytes.Compared with H/R group，MR-1 over-expression attenuated H/R-induced apoptosis(P＜0.01)，down-regulated CHOP expression(P＜0.05)，and increased Bcl-2/Bax ratio(P＜0.01).MR-1 over-expression suppressed H/R-induced PERK phosphorylation，Nrf2 nuclear translocation and ATF4 expression(P＜0.01).However，MR-1 knockdown aggravated H/R-induced apoptosis(P＜0.01)，up-regulated CHOP expression(P＜0.05)，and decreased Bcl-2/Bax ratio(P＜0.01).MR-1 knockdown up-regulated H/R-induced PERK phosphorylation(P＜0.05)，Nrf2 nuclear translocation and ATF4 expression(P＜0.01).CONCLUSION:MR-1 suppresses H/R-induced cardiomyocyte apoptosis by inhibiting PERK/Nrf2 pathway.

Apoptosis;Hypoxia/reoxygenation;Cardiomyocytes;Myofibrillogenesis regulator 1;Protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase;Nuclear factor E2-related factor 2

R363.1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.001

1000-4718(2014)02-0193-10

2013-10-15

2014-01-02

國家自然科學基金資助項目(No.81170140;No.81070130)

△通訊作者Tel:010-66939763;E-mail:xiuhualiu98@163.com