一測(cè)多評(píng)法測(cè)定新疆兩種洋甘菊中5種化學(xué)成分含量*

李建光,韓松林,2,趙東升,張海波,耿晶,李新霞

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,烏魯木齊 830054;2.阿克蘇職業(yè)技術(shù)學(xué)院,阿克蘇 843000;3.新疆比爾兄弟生物技術(shù)有限公司,烏魯木齊 830011)

一測(cè)多評(píng)法測(cè)定新疆兩種洋甘菊中5種化學(xué)成分含量*

李建光1,韓松林1,2,趙東升3,張海波1,耿晶1,李新霞1

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,烏魯木齊 830054;2.阿克蘇職業(yè)技術(shù)學(xué)院,阿克蘇 843000;3.新疆比爾兄弟生物技術(shù)有限公司,烏魯木齊 830011)

目的 建立新疆兩種洋甘菊中木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素的一測(cè)多評(píng)含量測(cè)定方法。方法采用超高效液相色譜法,以芹菜素為內(nèi)標(biāo)物,建立其與木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素的相對(duì)校正因子,并進(jìn)行含量測(cè)定,實(shí)現(xiàn)一測(cè)多評(píng)。同時(shí)采用外標(biāo)法測(cè)定11批洋甘菊中木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素的含量,驗(yàn)證一測(cè)多評(píng)法的準(zhǔn)確性。結(jié)果外標(biāo)測(cè)定法5種化學(xué)成分在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)均呈良好線性關(guān)系(r>0.999 3);平均加樣回收率分別為:木犀草苷99.7%、芹苷元-7-葡萄糖苷97. 5%、7-甲氧基香豆素98.8%、木犀草素100.9%、芹菜素99.1%,RSD分別為1.8%,0.6%,0.5%,1.8%,1.9%。一測(cè)多評(píng)法中芹苷元-7-葡萄糖苷、木犀草苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素相對(duì)芹菜素對(duì)照品的校正因子f分別為1.441,2.308,1. 117,1.490,RSD分別為0.07%,0.04%,0.09%,0.18%。采用一測(cè)多評(píng)法計(jì)算的含量值與外標(biāo)法實(shí)測(cè)值之間無(wú)顯著差異。結(jié)論在對(duì)照品缺乏、昂貴的情況下,以外標(biāo)法測(cè)定芹菜素,利用相對(duì)校正因子實(shí)現(xiàn)對(duì)木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素的含量測(cè)定可行。

母菊;羅馬洋甘菊;色譜法,超高效液相;一測(cè)多評(píng)法

新疆有兩種常用洋甘菊,一種是德國(guó)洋甘菊,為一年生草本植物,即母菊,學(xué)名:Matricaria chamomillaL.,植物名:Matricaria recμtita[1];一種是羅馬洋甘菊,一至多年生草本,學(xué)名:Anthemis nobileL.,植物名: Chamaemelum nobile。兩種洋甘菊都具有藥用價(jià)值[2-6]。洋甘菊有很悠久的使用歷史,《德國(guó)藥典》[7]、《美國(guó)藥典》[8]收載為母菊,《歐盟藥典》[9]收載為羅馬洋甘菊。我國(guó)《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)維吾爾藥分冊(cè)》收載為母菊,但只有顯微鑒別,沒(méi)有薄層鑒別和含量測(cè)定,現(xiàn)已列為國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高品種,本課題組擬建立母菊的藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

一測(cè)多評(píng)法(quantitativeanalysisofmulticomponents by single marker,QAMS)是一種用于多成分質(zhì)量控制的研究思路,用于解決中藥質(zhì)量控制中缺乏對(duì)照品這一瓶頸問(wèn)題[10],并成功應(yīng)用于中藥中同類型成分和不同類型成分的含量測(cè)定[11-15]。該方法已被《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版一部收錄[16]。

筆者在本研究中首先建立兩種洋甘菊的超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography,UPLC)測(cè)定條件,然后以芹菜素對(duì)照品為內(nèi)標(biāo)建立兩種洋甘菊中5種化學(xué)成分含量測(cè)定的一測(cè)多評(píng)法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 超高效液相色譜儀,Waters Acquity UPLC System,BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm) Empower色譜工作站;水浴鍋(PAIRSTIRRER PS-1000,50 Hz,0.75 kV,TOKYO RIKAKIKAI CO.,LTD); pH計(jì)(satRorius PB-10);離心機(jī)(MULTIFUGE X3R);分析天平(AB135-S)。

1.2 試藥 芹苷元-7-葡糖糖苷(成都普瑞科技有限公司,純度:99%,批號(hào):A110222),芹菜素(成都普瑞科技有限公司,純度:99%,批號(hào):A110605),7-甲氧基香豆素(美國(guó)西格瑪奧德里奇公司,SAFC,純度:98%,批號(hào):11409PC),木犀草苷(中國(guó)食品藥品檢定研究院,純度:99.3%,批號(hào):111720-200905),木犀草素(成都普瑞科技有限公司,純度:99%,批號(hào):L120321);乙腈[Fisher Scientific,賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司,純度:99.9%,批號(hào):20120112],甲醇[Fisher Scientific,賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司,純度: 99.9%,批號(hào):20120217],甲醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司,分析純,批號(hào):070911),N-N二甲基甲酰胺(天津市富宇精細(xì)化工有限公司,分析純,批號(hào): 110713);磷酸二氫鉀(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所,純度:99.5%,批號(hào):20100517),氫氧化鈉(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司,純度:96%,批號(hào):20111120),鹽酸(北京化工廠,分析純,批號(hào):20111020),磷酸(天津永晟精細(xì)化工有限公司,純度:85%,批號(hào):20120202)。母菊、羅馬洋甘菊均采自新疆各地區(qū)或購(gòu)買于新疆各市場(chǎng)。烏魯木齊市場(chǎng)購(gòu)樣1(批號(hào):20120613),2(批號(hào):20120605),3(批號(hào):20120608),4(批號(hào): 20120625)于2012年6月分別采于新疆昌吉呼圖壁縣、瑪納斯縣、吉木薩爾縣、奇臺(tái)縣。昌吉市場(chǎng)購(gòu)樣(批號(hào):20120706)于2012年7月采于昌吉市區(qū)。阜康樣、策勒樣均采于2012年5月。阜康樣(批號(hào): 20120514)采于新疆昌吉阜康市;策勒第一批樣(批號(hào):20120508)、策勒第2批樣(批號(hào):20120514)采于和田策勒縣。維吾爾醫(yī)院樣、和田樣、伊犁樣采收時(shí)間均為2012年7月。維吾爾醫(yī)院樣(批號(hào):20120703)來(lái)源于昌吉木壘縣,和田樣(批號(hào):20120710)采于和田市區(qū),伊犁樣(批號(hào):20120716)采于伊犁伊寧縣。所有樣品均保存于新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院分析測(cè)試中心。按照《美國(guó)藥典》對(duì)性狀的描述,經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院胡君萍教授對(duì)11個(gè)批次樣品鑒定確認(rèn)。其中阜康樣、策勒樣為母菊;烏魯木齊市場(chǎng)購(gòu)樣、昌吉市場(chǎng)購(gòu)樣、維吾爾醫(yī)院樣、和田樣、伊犁樣為羅馬洋甘菊。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 色譜條件 稀磷酸:取磷酸5.0 mL置于含水50 mL的100 mL量瓶中,加水至刻度,混勻。流動(dòng)相A:制備濃度為0.005 mol·L-1的磷酸二氫鉀溶液,用稀磷酸調(diào)節(jié)pH為2.55±0.05。流動(dòng)相B:制備乙腈和甲醇的混合物(65∶35)。

色譜柱BEHC18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm);流速: 0.3 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng):335 nm;溫度為37℃;進(jìn)樣量1.5 μL;按照表1程序進(jìn)行洗脫。典型色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 洗脫程序Tab.1 Elution program

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取芹苷元-7-葡萄糖苷、芹菜素、木犀草苷,精密稱定后分別溶于適量N-N二甲基甲酰胺后以甲醇稀釋,使?jié)舛确謩e為1.317, 1.246,1.085 mg·mL-1,取7-甲氧基香豆素、木犀草素精密稱定后分別溶于甲醇,使?jié)舛确謩e為1.042和1.059 mg·mL-1。

2.1.3 供試品溶液的制備 取母菊1.0 g,精密稱定后置一裝有回流冷凝器和攪拌器的燒瓶中,加甲醇80 mL,攪拌下加熱回流1 h。冷至室溫,濾過(guò),收集濾液于100 mL量瓶。用甲醇3 mL沖洗燒瓶,沖洗液過(guò)濾后并入量瓶中,加甲醇至刻度,混勻并過(guò)濾。取上述溶液25.0 mL置一裝有回流冷凝器和攪拌器的圓底燒瓶中,加氫氧化鈉溶液5.0 mL(將氫氧化鈉0.4 g溶于水5.0 mL制成),加熱回流25 min。冷卻,用36%～38%鹽酸調(diào)節(jié)該溶液pH至5.0～6.2。定量轉(zhuǎn)移此溶液于50 mL量瓶,用甲醇稀釋至刻度,混勻并過(guò)濾,棄去初濾液10 mL,取續(xù)濾液作為供試品溶液。同法制備羅馬洋甘菊供試品溶液。

1.木犀草苷;2.芹苷元-7-葡萄糖苷;3.7-甲氧基香豆素;4.木犀草素;5.芹菜素圖1 母菊(A)、羅馬洋甘菊(B)、混標(biāo)(C)UPLC典型色譜圖1.galuteolin;2.apigenin-7-glucoside;3.7-methoxycoumarin; 4.luteolin;5.apigeninFig.1 Typical UPLC chromatograms of Chamomile, Roman Chamomile,and mixed reference substance

2.1.4 線性范圍、檢出限和定量限 分別精密吸取不同體積“2.1.2”項(xiàng)下(1.085 mg·mL-1木犀草苷、1.317 mg·mL-1芹苷元-7-葡萄糖苷、1.042 mg·mL-17-甲氧基香豆素、1.059 mg·mL-1木犀草素、1.246 mg·mL-1芹菜素)對(duì)照品貯備溶液,制成含木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素不同質(zhì)量濃度的系列混合溶液。按上述色譜條件測(cè)定,以對(duì)照品濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程,得木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素回歸方程分別為:Y1=11 381X1-121.98(r=0.999 9),線性范圍0.054～10.85 μg·mL-1;Y2=17 149X2-422.28(r=0.999 9),線性范圍0.659～72.44 μg·mL-1;Y3=25 628X3+607.15(r=0.999 5),線性范圍0.010～10.42 μg·mL-1;Y4=21 425X4-887.50(r= 0.999 9),線性范圍0.021～10.59 μg·mL-1;Y5= 28 342X5-2 552.60(r=0.999 3)線性范圍0.125～12.46 μg·mL-1。結(jié)果表明各成分在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。當(dāng)信噪比為3∶1和10∶1時(shí),測(cè)得木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素的檢出限分別為0.006,0.067,0.001, 0.002,0.013 μg·mL-1;測(cè)得木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素的定量限分別為0.021,0.214,0.004,0.007,0.046 μg·mL-1。

2.1.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一混合對(duì)照品溶液,在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次,木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素含量的RSD分別為1.00%,0.75%,0.35%,1.10%,0.82%,表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品1 g,6份,按供試品溶液的制備法制備并進(jìn)樣測(cè)定洋甘菊中5種化學(xué)成分含量,RSD分別為1.10%,0.44%,0.37%,1.20%, 1.30%,表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取“2.1.6”項(xiàng)下同一供試品溶液在室溫下0,2,4,6,8,10,12 h分別進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果,12 h內(nèi)洋甘菊中5種化學(xué)成分色譜峰面積無(wú)明顯變化,RSD分別為0.96%,0.25%,0.76%,1.10%, 0.48%,表明被測(cè)樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品約0.5 g,共9份,分為3組,按低、中、高濃度分別加入木犀草苷等5種對(duì)照品儲(chǔ)備液,按“2.1.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液,進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算加樣回收率,木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素的加樣回收率分別為99.7%,97.5%,98.8%, 100.9%,99.1%,RSD分別為1.8%,0.6%,0.5%, 1.8%,1.9%。

2.2 校正因子測(cè)定及相對(duì)保留時(shí)間考察

2.2.1 校正因子的測(cè)定 將已知濃度的芹苷元-7-葡萄糖苷、木犀草苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素對(duì)照品混合溶液按低、中、高濃度1,1.5,2 μL(n=3)注入超高效液相色譜儀,記錄色譜圖,以芹菜素色譜峰為內(nèi)標(biāo),計(jì)算相對(duì)響應(yīng)值作為校正因子。結(jié)果表明:芹苷元-7-葡萄糖苷、木犀草苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素對(duì)照品對(duì)芹菜素對(duì)照品的相對(duì)校正因子分別為1.441,2.308,1.117,1.490。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 校正因子測(cè)定Tab.2 Determination on correction factor

2.2.2 相對(duì)保留時(shí)間的考察 本研究考察了Waters Acquity UPLC,Waters alliance HPLC液相色譜系統(tǒng),使用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm× 50 mm,1.7 μm),Agilent(4.6 mm×250 mm,5 μm), Atlantic(4.6 mm×250 mm,5 μm),Phenomenex (4.6 mm×250 mm,5 μm)4種不同品牌和型號(hào)的色譜柱。取混合對(duì)照品溶液,注入液相色譜儀,測(cè)定,以芹菜素為內(nèi)標(biāo)物,計(jì)算木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素的校正因子和相對(duì)保留值,結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3 待測(cè)組分色譜峰的定位 本研究采用木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素與內(nèi)標(biāo)物芹菜素的相對(duì)保留值作為色譜峰定位標(biāo)準(zhǔn),并考察了其在不同品牌儀器和不同規(guī)格色譜柱上的重復(fù)性。結(jié)果表明相對(duì)保留值波動(dòng)較小,木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素相對(duì)芹菜素的平均值分別為0.257,0.385,0.684,0.73,RSD分別為1.2%,0.3%,0.19%,0.07%。因此本研究選用相對(duì)保留值作為目標(biāo)色譜峰的定位指標(biāo)比較合適。并且在此色譜條件下各批洋甘菊樣品的色譜峰相對(duì)簡(jiǎn)單,因此在實(shí)際應(yīng)用“一測(cè)多評(píng)”法時(shí),可參考藥材典型色譜圖,利用相對(duì)保留值定位,根據(jù)內(nèi)標(biāo)物芹菜素的保留時(shí)間,通過(guò)相對(duì)保留值結(jié)合木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素色譜峰的紫外吸收特征,能夠正確判斷目標(biāo)峰的準(zhǔn)確峰位置。

2.4 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果的比較 采用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法,以“2.1.1”項(xiàng)色譜條件對(duì)11批洋甘菊中5種化學(xué)成分木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果顯示,兩種方法所得含量值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明一測(cè)多評(píng)法可用于洋甘菊的多成分質(zhì)量評(píng)價(jià)研究。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)在對(duì)照品溶液的制備過(guò)程中發(fā)現(xiàn),芹苷元-7-葡萄糖苷、芹菜素、木犀草苷對(duì)照品不易溶于甲醇,故在制備過(guò)程中先溶于適量N-N二甲基甲酰胺后再用甲醇稀釋。

一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果的相對(duì)偏差＜0.5%,表明上述兩種方法差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)中建立的以芹菜素對(duì)照品為內(nèi)標(biāo)的一測(cè)多評(píng)法具有可行性,只需用芹菜素對(duì)照品,即可進(jìn)行多指標(biāo)同步測(cè)定,可替代外標(biāo)測(cè)定法用于兩種洋甘菊的質(zhì)量分析。本實(shí)驗(yàn)中尤其木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷價(jià)格昂貴,以兩種洋甘菊中均含成分、價(jià)格相對(duì)便宜的芹菜素為內(nèi)標(biāo),同時(shí)測(cè)定木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素的含量,從而實(shí)現(xiàn)以一種對(duì)照品對(duì)多個(gè)成分進(jìn)行質(zhì)量控制,在質(zhì)量評(píng)價(jià)中,能較大降低測(cè)定成本。本實(shí)驗(yàn)選用UPLC色譜系統(tǒng)一測(cè)多評(píng)法同時(shí)分析5種成分,分離效果較HPLC更好,分離時(shí)間更短。

表3 相對(duì)保留時(shí)間考察Tab.3 Test on relative retention time

表4 外標(biāo)法和QAMS測(cè)定洋甘菊中木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素的含量Tab.4 Content determination on galuteolin,apigenin-7-glucoside,7-methoxycoumarin,luteolin and apigenin in Chamomiles by external standard method and QAMS mg·g-1,n=2

《美國(guó)藥典》中測(cè)定芹苷元-7-葡萄糖苷的含量,同時(shí)規(guī)定7-甲氧基香豆素,芹菜素,順式螺醚、反式螺醚的相對(duì)保留時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)中以芹菜素為對(duì)照,同時(shí)測(cè)定木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素的含量,更適用于中藥材的質(zhì)量控制。

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DOI 10.3870/yydb.2014.11.025

Determination of Five Compounds from Two Species of Chamomiles from Xinjiang by QAMS

LI Jian-guang1,HAN Song-lin1,2,ZHAO Dong-sheng3,ZHANG Hai-bo1,GENG Jing1,LI Xin-xia1
(1. Pharmaceutical College,Xinjiang Medical University,Urumqi 830054,China;2.AKSu Vocational And Technical College,AKSu 843000,China;3.Xinjiang Bill Brother Biotechnology Company.,LTD,Urumqi 830011,China)

ObjectiveTo establish a method of simultaneously quantitative analysis for multi-components by single marker(QAMS)of galuteolin,apigenin-7-glucoside,7-methoxycoumarin,luteolin and apigenin in two species ofChamomilesfromXinjiang.MethodsBy using apigenin as the internal standard,the relative correction factors(RCF)of galuteolin,apigenin-7-glucoside,7-methoxycoumarin and luteolin were set and determined by UPLC.The contents of galuteolin,apigenin-7-glucoside,7-methoxycoumarin,luteolin and apigenin in 11 samples ofChamomileswere authentically determined by the external standard method,to verify the accuracy of QAMS.ResultsThere is a good linear relationship within the range of standard curve for five compounds by the external standard method(r>0.999 3);the average recovery was 99.7%,97.5,98.8%,100.9%,99.1%,for galuteolin,apigenin-7-glucoside,7-methoxycoumarin,luteolin and apigenin,respectively,with RSD as 1.8%,0.6%,0.5%, 1.8%and 1.9%,respectively.The RCF for pigenin-7-glucoside,galuteolin,7-methoxycoumarin and luteolin to apigenin was 1. 441,2.308,1.117,1.490,respectively,with RSD as 0.07%,0.04%,0.09%and 0.18%,respectively.No significant difference between the quantitative results by QAMS and external standard method was observed.ConclusionIt is practical to determine content of galuteolin,apigenin-7-glucoside,7-methoxycoumarin,luteolin with RCF and apigenin by using external standard method,for the deficiency and expensive of the standard reference.

Chamomile;Roman chamomile;UPLC;Quantitative analysis of multi-components by single marker

R286;R927.2

B

1004-0781(2014)11-1491-05

2013-10-25

2013-12-02

*新疆維吾爾自治區(qū)科技廳高技術(shù)研究項(xiàng)目(201316102);新疆醫(yī)科大學(xué)2011-2012學(xué)年博士(后)科研啟動(dòng)金配套資助項(xiàng)目

李建光(1977-),男,新疆烏魯木齊人,副教授,博士,主要從事藥物分析與天然藥物化學(xué)研究。電話:0991-4361362,E-mail:L77117@163.com。

李新霞(1968-),女,新疆烏魯木齊人,教授,博士,主要從事分析測(cè)試技術(shù)與新藥研發(fā)工作。電話:0991-4365034,E-mail:lxx6668@163.com。