高效液相色譜法同時測定板藍根藥材中5種成分的含量*

肖平,陳建偉,李祥,李進

(南京中醫藥大學藥學院,南京 210023)

·藥物制劑與藥品質量控制·

高效液相色譜法同時測定板藍根藥材中5種成分的含量*

肖平,陳建偉,李祥,李進

(南京中醫藥大學藥學院,南京 210023)

目的 建立高效液相色譜法同時測定板藍根藥材中尿嘧啶、次黃嘌呤、鳥苷、胸腺嘧啶、(R,S)-告依春5種成分的含量。方法Hanbon Hedera C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相乙腈(A)-水(B),線性梯度洗脫,流速1.0 mL·min-1;檢測波長254 nm,柱溫30℃。結果尿嘧啶、次黃嘌呤、鳥苷、胸腺嘧啶、(R,S)-告依春的線性范圍分別為1.97～39.40 mg·L-1(r=0.999 9),1.25～50.00 mg·L-1(r=0.999 9),0.25～10.40 mg·L-1(r=0.999 6),2.84～56.70 mg·L-1(r=0.999 9),0.72～28.80 mg·L-1(r=0.999 8);平均回收率分別為99.36%(RSD=0.91%),99.79% (RSD=1.12%),100.90%(RSD=1.71%),98.67%(RSD=1.50%),99.33%(RSD=0.94%)。結論該方法簡便,重復性好,靈敏度高,結果準確可靠,可作為板藍根質量控制的有效方法。

板藍根;核苷;告依春;色譜法,高效液相;含量測定

板藍根為十字花科植物菘藍(Isatis indigoticaFort.)的干燥根,具有清熱解毒、涼血利咽等功效[1],臨床上常用于病毒及細菌感染性疾病,尤其在抗病毒方面療效確切[2]。板藍根含有生物堿、有機酸、苯丙素、氨基酸、核苷等成分[3]。(R,S)-告依春為板藍根中的抗病毒活性成分之一,2010年版《中華人民共和國藥典》采用反相高效液相色譜(reverse phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)法測定板藍根中(R,S)-告依春的含量并對其進行質量控制[1-4]。核苷類成分大多具有抗病毒、抗菌、抗腫瘤、提高免疫力等活性,是板藍根中抗病毒的有效部位之一[5-6]。近年來高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法測定板藍根及其制劑中(R,S)-告依春、腺苷、尿苷、鳥苷含量的文獻報道較多[7-9],但筆者未見對板藍根藥材中尿嘧啶、次黃嘌呤、胸腺嘧啶進行含量測定的報道。本研究首次采用HPLC同時測定10批次板藍根藥材中尿嘧啶、次黃嘌呤、鳥苷、胸腺嘧啶、(R,S)-告依春含量,以期為板藍根的質量控制提供參考依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1200 HPLC配G1315D型DAD檢測器(美國Agilent公司),電子天平(SHIMADZU,AY-220型)。

1.2 試藥 尿嘧啶對照品(批號:20331-201207,純度: 99.8%)、次黃嘌呤對照品(批號:20333-201205,純度: 98.7%)、鳥苷對照品(批號:20332-201205,純度: 98.9%)、胸腺嘧啶對照品(批號:20330-201209,純度: 99.9%)均購自南昌貝塔生物技術有限公司。(R,S)-告依春對照品(批號:10122601,純度:99.5%)購自揚子江藥業集團南京海陵藥業有限公司。各對照品經HPLC法檢測純度均>98%。乙腈(MERCK公司,色譜純,批號:1102374),水為超純水(由Millipore純水器制得),其他試劑均為分析純。板藍根藥材采集于全國各地,經南京中醫藥大學生藥學教研室陳建偉教授鑒定為十字花科植物菘藍(Isatis indigoticaFort.)的干燥根。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Hanbon Hedera C18色譜柱(4.6 mm× 250 mm,5 μm);流動相:乙腈(A)-水(B),線性梯度洗脫,0～6 min,100%B,～25 min,100%B→90%B,～29 min,90%B→75%B;流速:1.0 mL·min-1;檢測波長254 nm;柱溫30℃;進樣量10 μL。根據液相色譜保留時間和紫外光譜信息對5種成分進行指認,各色譜峰的峰形及分離度較好,結果見圖1[10]。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取于干燥器中放置>24 h的尿嘧啶、次黃嘌呤、鳥苷、胸腺嘧啶、(R,S)-告依春對照品適量,精密稱定,加水配成濃度分別為394.0,250. 0,104.0,1 134.0,144.0 mg·L-1的對照品儲備液。分別移取一定體積的上述對照品儲備液于量瓶定容,配成含尿嘧啶、次黃嘌呤、鳥苷、胸腺嘧啶、(R,S)-告依春濃度分別為78.8,50.0,10.4,113.4,28.8 mg·L-1的混合儲備溶液,備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 參照2010年版《中華人民共和國藥典》方法,并稍作調整,取板藍根藥材粉末(過4號篩,篩孔內徑250 μm)約1 g,精密稱定,置圓底燒瓶中,精密加入純化水50 mL,稱定質量,連續回流提取2 h后放冷,再稱定質量,用水補足減少的質量。搖勻,取上清液適量過孔徑0.45 μm微孔濾膜,取續濾液作為供試品溶液[1]。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 取尿嘧啶、次黃嘌呤、鳥苷、胸腺嘧啶、(R,S)-告依春混合對照品儲備溶液,按不同比例加水稀釋成7個不同濃度,按含量測定方法測定。以對照品質量濃度(mg·L-1)為橫坐標(X),以相應對照品峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸,得線性回歸方程及相關系數。將上述混合對照品溶液進行逐級稀釋,進樣分析,以信噪比(S/N)約為10計定量限,以S/N約為3計檢出限,線性回歸參數、檢測限、定量限結果見表1。

A.對照品;B.樣品;1.尿嘧啶;2.次黃嘌呤;3.鳥苷;4.胸腺嘧啶;5.(R,S)-告依春圖1 對照品和樣品的HPLC圖A.reference substances;B.Sample;1.uracil;2.hypoxanthine; 3.guanosine;4.thymine 5.(R,S)-goitrinFig.1 HPLC chromatograms of reference substances and sample

2.3.2 精密度實驗 取同一混合對照品溶液在上述色譜條件下連續進樣6次,尿嘧啶、次黃嘌呤、鳥苷、胸腺嘧啶、(R,S)-告依春峰面積的RSD(n=6)分別為0.4%, 0.4%,2.0%,0.1%,0.2%,表明該儀器精密度良好。

2.3.3 重復性實驗 取同一批板藍根藥材粉末(S2)按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法平行處理6份,進行測定,以峰面積外標法計算含量,尿嘧啶、次黃嘌呤、鳥苷、胸腺嘧啶、(R,S)-告依春的含量分別為0.45,0.54,0.06,0.01,0.20 mg·g-1,RSD(n=6)分別為0.5%,2.5%,1.9%,2.3%,2.6%,結果表明該方法重復性良好。

2.3.4 穩定性實驗 取同一批次板藍根藥材粉末,按“2.2.2”項供試品溶液制備方法操作,制備供試品溶液,分別在0,2,4,6,8,12,24 h進樣分析,測得尿嘧啶、次黃嘌呤、鳥苷、胸腺嘧啶、(R,S)-告依春含量的RSD(n=7)分別為0.3%,1.1%,2.3%,2.1%,1.8%,表明供試品溶液室溫放置24 h內穩定。

表1 5種成分的回歸方程、相關系數、線性范圍、定量限和檢出限Tab.1 Regression equations,correlation coefficients(r),linear ranges,limits of quantification(LOQ)and limits of detection (LOD)of five compounds

2.3.5 加樣回收率實驗 精密稱取同批次已知含量的板藍根藥材粉末(S10)約0.2 g,共6份,每份按一定比例加入適量尿嘧啶、次黃嘌呤、鳥苷、胸腺嘧啶、(R,S)-告依春對照品儲備液,按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法制備,按“2.1”項色譜條件進樣分析,計算回收率結果,見表2。

表2 5成分加樣回收率實驗結果Tab.2 Recoveries of five compounds n=6

2.4 樣品測定 取不同批次板藍根藥材粉末,按“2.2.2”項供試品溶液制備方法制備樣品,按“2.1”項色譜條件進行含量測定,計算各批次藥材不同成分的平均含量(n=3),結果見表3。

表3 不同產地板藍根5種成分含量測定結果Tab.3 Contents of five compounds in Radix Isatidis from different districts n=3,mg·g-1

3 討論

3.1 供試品溶液配制方法的選擇 本實驗選用水和80%甲醇作為提取溶劑進行提取,比較發現水提取效率較高且對人體無毒害,故選擇水作為提取溶劑。比較了煎煮、回流提取與超聲提取3種提取方法,發現回流提取效率優于其他兩種提取方法,且可以減少提取溶劑的損失。在此基礎上,考察了回流提取時間對實驗結果的影響,結果表明采用水連續回流提取2 h后5種成分基本提取完全。

3.2 高效液相色譜條件的建立 《中華人民共和國藥典》2010年版中板藍根的指標性成分是(R,S)-告依春,檢測波長為245 nm,在200～400 nm范圍內用二極管陣列檢測器對樣品進行全波長掃描,5種成分的最大吸收波長在240～265 nm范圍內,在254 nm處色譜峰數較多,且所測成分的響應值較大,綜合考慮選擇254 nm作為檢測波長。在流動相系統的選擇中,試用了甲醇-0.02%磷酸溶液、甲醇-水-0.2%甲酸、水-乙腈3種流動相系統,結果表明采用水-乙腈系統時分離度較好。由于所測的成分極性較大,起始時較大比例的乙腈造成出峰時間過于提前,經摸索后確定選用水-乙腈系統梯度洗脫,5種成分分離效果較好,可避免使用緩沖鹽作為流動相造成色譜柱的損害,延長色譜柱使用壽命。

3.3 含量測定結果分析 《中華人民共和國藥典》2010年版中規定(R,S)-告依春含量不得低于0.020%,10批次藥材中產于安徽和四川綿陽的板藍根(R,S)-告依春含量分別為0.012%,0.013%,低于《中華人民共和國藥典》(2010年版)標準,其他批次藥材均符合標準。從5種成分總量來看,產自甘肅河西(S3)的板藍根含量最高,而同產自于甘肅的S4樣品的總含量最低。10批次板藍根中胸腺嘧啶含量普遍都較低,產自于內蒙古赤峰的板藍根中尿嘧啶和次黃嘌呤的含量均最高,而產自甘肅的S4樣品中尿嘧啶和次黃嘌呤含量最低。不同批次板藍根藥材中各成分的含量差異性較大,即使同一產地的板藍根藥材中核苷類成分含量差異也較大。

本實驗首次采用高效液相法同時測定板藍根藥材中尿嘧啶、次黃嘌呤、鳥苷、胸腺嘧啶、(R,S)-告依春的含量。該方法簡便,測定結果準確、可靠,重復性較好,可用于板藍根藥材及其制劑的質量控制。

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DOI 10.3870/yydb.2014.11.023

Simultaneous Determination of Five Compounds in Isatidis Radix by HPLC

XIAO Ping,CHEN Jian-wei,LI Xiang,LI Jin
(College of Pharmacy,Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023,China)

ObjectiveTo establish a HPLC method for simultaneous determination of uracil,hypoxanthine,guanosine, thymine,and(R,S)-goitrin inIsatidis Radix.MethodsThe determination was performed on a Hanbon Hedera C18column (4.6 mm×250 mm,5 μm).The mobile phase consisted of acetonitrile(A)and water(B)with linear gradient elution at the flow rate of 1.0 mL·min-1.The column temperature was 30℃.Detection wavelength was 254 nm.ResultsThe linear range of uracil,hypoxanthine,guanosine,thymine,and(R,S)-goitrin was 1.97-39.40 mg·L-1(r=0.999 9),1.25-50.00 mg·L-1(r= 0.999 9),0.25-10.40 mg·L-1(r=0.999 6),2.84-56.70 mg·L-1(r=0.999 9),and 0.72-28.80 mg·L-1(r=0.999 8), respectively.The average recovery was 99.36%(RSD=0.91%),99.79%(RSD=1.12%),100.90%(RSD=1.71%),98.67% (RSD=1.50%),and 99.33%(RSD=0.94%),respectively.ConclusionThe method is simple,accurate,reliable,reproducible and sensitive,which can be used as an effective method for quality control ofIsatidis Radix.

Isatidis Radix;Nucleosides;(R,S)-goitrin;HPLC;Content determination

R286;R927.2

B

1004-0781(2014)11-1481-05

2013-10-25

2013-11-22

*國家自然科學基金資助項目(81073023);江蘇省產學研聯合創新獎金項(BY2009109);南京中醫藥大學“康緣中醫藥科技創新基金”項目(HZ0808KY);江蘇高校優勢學科建設工程資助項目(YSXK-2010);江蘇省2013年度普通高校研究生科研創新計劃項目(CXZZ13_06)

肖平(1987-),男,湖南衡陽人,在讀博士,主要從事中藥質量標準、藥效物質基礎研究。電話:025-85811512, E-mail:pingxiao58@126.com。

李祥(1953-),女,教授,博士生導師,從事中藥藥效物質基礎研究。電話:025-85811512,E-mail:lixiang_8182 @163.com。