鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠Raf-1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響*

謝鑫,張林,陳士玉,楊芳,張立德

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,沈陽(yáng) 110032)

鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠Raf-1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響*

謝鑫,張林,陳士玉,楊芳,張立德

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,沈陽(yáng) 110032)

目的 研究不同劑量鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)心血管組織Raf-1蛋白和Raf-1 mRNA表達(dá)的影響。方法將50只24周齡SHR隨機(jī)分為模型對(duì)照組、中藥小劑量組、中藥中劑量組、中藥大劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組,每組10只,同源雄性魏-凱二氏大鼠(WKY)10只作為正常對(duì)照組。灌胃給藥5周后,Western Blot法測(cè)定心血管組織Raf-1蛋白表達(dá),實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法測(cè)定大鼠Raf-1 mRNA基因表達(dá)。結(jié)果與模型對(duì)照組比較,其他各組大鼠Raf-1蛋白和Raf-1 mRNA表達(dá)均明顯升高(F=1 139.282,sig=0.000,P＜0.01)。結(jié)論鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯可促進(jìn)SHR心血管細(xì)胞Raf-1蛋白和Raf-1 mRNA表達(dá),刺激細(xì)胞增殖和分化,抑制細(xì)胞凋亡。

鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯;高血壓,自發(fā)性;Raf-1 mRNA

隨著生活飲食的改變、社會(huì)環(huán)境的變化,以及工作節(jié)奏和壓力的變化等,高血壓疾病患者逐年增多,且呈年輕化趨勢(shì)。高血壓是以血壓增高為主,伴有心血管組織病變、心血管細(xì)胞凋亡增多的一類(lèi)疾病。Raf蛋白激酶是由raf基因編碼的蛋白產(chǎn)物,其分子結(jié)構(gòu)中含有3個(gè)保守區(qū),分別為CR1、CR2、CR3。CR1位于其分子的氨基端,富含半胱氨酸,含有鋅指樣結(jié)構(gòu),與蛋白激酶C的配體結(jié)合區(qū)結(jié)構(gòu)相似,是活化的Ras與Raf-1蛋白激酶結(jié)合的主要部位。Raf-1蛋白在心血管組織中大量表達(dá),Raf蛋白參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、抑制細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期停滯等作用[1]。鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯出自《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》[2],具有鎮(zhèn)肝息風(fēng)、滋陰潛陽(yáng)作用,用于治療肝陽(yáng)上亢、氣血上逆證,臨床可改善陰虛陽(yáng)的癥狀,治療高血壓及其并發(fā)癥具有一定療效。筆者在本實(shí)驗(yàn)中以自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)為研究對(duì)象,觀察鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對(duì)心血管組織纖維肉瘤蛋白1(rapidly accelerated fibrosarcoma 1,Raf-1)蛋白表達(dá)和Raf-1 mRNA表達(dá)的影響,以及該藥對(duì)心血管細(xì)胞凋亡的影響,探討鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對(duì)原發(fā)性高血壓降血壓的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 20周齡雄性SHR50只,雄性魏-凱二氏大鼠(Wistar-Kyoto rats,WKY)10只,體質(zhì)量(200±20) g,SPF級(jí)別,購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2012-00011,動(dòng)物合格證號(hào):20120038。飼養(yǎng)條件:動(dòng)物室溫度20～25℃,相對(duì)濕度45%～55%。

1.2 藥物與試劑 鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯:生代赭石30 g(先煎)、生龍骨15 g(先煎)、生牡蠣15 g(先煎)、炙龜板15 g(先煎)、牛膝30 g、鉤藤15 g、黃芩15 g、梔子15 g、甘草5 g、白芍20 g、丹參20 g、川芎15 g、玄參15 g,藥材采購(gòu)自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥店(產(chǎn)地山東,中藥經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院張林老師鑒定,均為合格正品);藥材常規(guī)煎煮水提,加水1 400 mL(8倍量),浸泡30 min,其中生代赭石、生龍骨、生牡蠣、炙龜板先煎20 min,再加入方中其余藥材,煎煮25 min,煎好后用8層紗布過(guò)濾,收集藥液。完達(dá)山5%脫脂奶粉(批號(hào): 1013163904);一抗兔抗大鼠Raf-1抗體(Cell Signaling Technology:04-739)(批號(hào):04-739);二抗羊抗兔堿性磷酸酶(alkalinephosphatase)標(biāo)記(批號(hào): MFCD03839167);引物:上游5'-AGAGGCAGAGGTCAACG-3',下游5'-CGAGCCAATCCGAGTA-3',反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)試劑盒和實(shí)時(shí)定量試劑盒購(gòu)于TaKaRa(RR014A);PCR擴(kuò)增儀(9700,ABI),核糖核酸提取試劑盒(Triozol Reagent, Invitrogen Life technologies,15596-026,上海科敏生物科技有限公司);722分光光度計(jì)(上海精科實(shí)業(yè)有限公司,722N)。

1.3 藥物劑量與分組 按人與大鼠體表面積比換算給藥等效劑量[3],大鼠給藥劑量=X(mg·kg-1)× 70 kg×0.018/(200 g)=X(mg·kg-1)×70 kg×0.018/ (0.2 kg)=6.3X(mg·kg-1)=(260/60)×6.3= 27.09 g·kg-1。中藥小劑量組:13.5 g·kg-1,中藥中劑量組:27.1 g·kg-1,中藥大劑量組:54.2 g·kg-1,給藥濃度分別是2.5,5.0,10 g·mL-1,復(fù)方羅布麻片0.126 g·kg-1,濃度0.02g·mL-1,灌胃體積1.08 mL·d-1,早晚各灌胃1次,連續(xù)給藥30 d。

采用隨機(jī)數(shù)字表法,將健康雄性50只SHR分成5組:模型對(duì)照組(0.9%氯化鈉溶液)、中藥小劑量組(鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯13.5 g·kg-1)、中藥中劑量組(鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯27.1 g·kg-1)、中藥大劑量組(鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯54.2 g·kg-1)、陽(yáng)性對(duì)照組(復(fù)方羅布麻片混懸液, 0.126 g·kg-1),每組10只。健康同源性WKY大鼠10只,作為正常對(duì)照組(0.9%氯化鈉溶液)。

1.4 Western blot測(cè)定 每組大鼠取主動(dòng)脈弓后,每個(gè)樣本加入總蛋白裂解液,在冰塊中操作勻漿,酚試劑法進(jìn)行蛋白定量,用722分光光度計(jì)在波長(zhǎng)650 nm處測(cè)定吸光度(A)值,配成同體積同濃度后,加入電泳緩沖液(Running Buffer)煮沸,加樣進(jìn)行分離膠和濃縮膠板中跑膠,取膠放入轉(zhuǎn)印槽中轉(zhuǎn)移,取出轉(zhuǎn)印膜,5%脫脂奶粉封閉,漂洗液(Tween 20 in trisbuffer saline, TTBS)清洗,加入一抗(1∶1 000稀釋),加入二抗(1∶300稀釋),加入堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)色液顯色。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)(Real Time RT-PCR)測(cè)定 每個(gè)樣本加入TRIzol法抽提總RNA,在冰浴中迅速勻漿,加入三氯甲烷,12 000×g離心15 min(4℃),吸取上清液,加入異丙醇搖勻, 12 000×g離心15 min(4℃),棄去上清液,加75%乙醇1 mL,7 500×g離心(30 min,4℃),棄去上清液,加無(wú)核酸酶水(Nuclease free water)。采用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定260和280nm波長(zhǎng)處的A值,配成同體積同濃度后,加入RT-PCR試劑盒中試劑(按說(shuō)明書(shū)操作)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,加入Real-time PCR試劑進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增(按說(shuō)明書(shū)操作)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0版統(tǒng)計(jì)軟件處理所得數(shù)據(jù),選用ONE WAY ANOVA方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Western blot結(jié)果 見(jiàn)圖1和圖2。與模型對(duì)照組比較,其他各組Raf-1蛋白表達(dá)明顯升高(F= 1 868.267,sig=0.000,P＜0.01)。

2.2 Real Time RT-PCR結(jié)果 見(jiàn)圖3～圖7。與模型對(duì)照組比較,其他各組Raf-1 mRNA表達(dá)明顯升高(F=1 139.282,sig=0.000,P＜0.01)。

圖1 6組Raf-1與GAPDH蛋白表達(dá)Fig.1 Protein expression of Raf-1 and GAPDH in six groups

與模型對(duì)照組比較,*1P＜0.01圖2 6組Raf-1/GAPDH灰度值比較Compared with model control group,*1P＜0.01Fig.2 Comparison of the ratio of Raf-1 grayscale to GAPDH grayscale among six groups

圖3 心血管組織中Raf-1擴(kuò)增曲線Fig.3 Amplification curve of Raf-1 in cardiovascular tissue

3 討論

Raf-1是大鼠肉瘤蛋白/纖維肉瘤蛋白/絲裂原活化蛋白激酶(Ratsarcoma/RapidlyAccelerated Fibrosarcoma/mitogen-activated protein kinase,Ras/Raf-1/MAPK)細(xì)胞增殖信號(hào)傳導(dǎo)途徑中重要的因子,Raf-1與其他信號(hào)傳導(dǎo)存在聯(lián)系。Raf-1被激活后,使其下游的絲裂素活化蛋白激酶活化,通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子表達(dá)的影響而將細(xì)胞增殖信號(hào)傳遞到細(xì)胞核內(nèi)[3]。Raf-

圖4 心血管組織中Raf-1融解曲線Fig.4 Dissolution curve of Raf-1 in cardiovascular tissue

圖5 內(nèi)參GAPDH擴(kuò)增曲線Fig.5 Amplification curve of GAPDH

圖6 內(nèi)參GAPDH融解曲線Fig.6 Dissolution curve of GAPDH

與模型對(duì)照組比較,*1P＜0.01圖7 Raf-1/GAPDH mRNA擴(kuò)增比值Compared with model control group,*1P＜0.01Fig.7 Amplification ratio of Raf-1 mRNA to GAPDH mRNA

1參與細(xì)胞分化過(guò)程,細(xì)胞分化過(guò)程中均發(fā)現(xiàn)伴有Raf-1、MAPK活性增高。Raf-1還參與抑制細(xì)胞凋亡過(guò)程[4]。

大量研究表明[5-6],長(zhǎng)期原發(fā)性高血壓會(huì)引起心血管細(xì)胞大量凋亡,血管壁結(jié)構(gòu)改變,失去彈性,會(huì)造成動(dòng)脈痙攣,血管內(nèi)壓持續(xù)升高,血管內(nèi)皮細(xì)胞初期通過(guò)細(xì)胞骨架來(lái)適應(yīng)調(diào)節(jié),然而最終不能承受血壓持續(xù)升高和長(zhǎng)期的作用,血管壁滲透性增多,血漿蛋白的滲入和未壞死血管中膜層產(chǎn)生蛋白多糖、修復(fù)性膠原纖維,減少血管細(xì)胞壁細(xì)胞,而Raf-1蛋白是參與細(xì)胞凋亡途徑中重要的因子之一。

鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯的方劑出自《醫(yī)學(xué)衷中西參錄》[7],本方證是由陰虛陽(yáng)亢、肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)所致。臨床應(yīng)用有較好的效果,方中重用懷牛膝,降其上行之血并能滋養(yǎng)肝腎;若肝陽(yáng)上升,肺胃之氣隨之也升,故以赭石降肝胃之逆氣,并能平肝潛陽(yáng)為主藥;諸藥合用,順肝臟條達(dá)之性,自可趨于和平。使陰足陽(yáng)潛,氣血以和,其風(fēng)當(dāng)自平,則成鎮(zhèn)肝熄風(fēng)之劑[8-10]。本實(shí)驗(yàn)證明,鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯能促進(jìn)SHR心血管細(xì)胞中Raf-1蛋白表達(dá)和Raf-1 mRNA表達(dá),刺激細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化,抑制心血管細(xì)胞凋亡程序,從而保持心肌細(xì)胞功能和活性,起到降低血壓、保護(hù)心血管組織的作用。

[1] TOKO H,KONSTANDIN M H,DOROUDGAR S,et al. Regulation of cardiac hypertrophic signaling by prolyl isomerase Pin1[J].Circ Res,2013,112(9):1244-1252.

[2] 王雅娟,卞海,劉金林,等.鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性心肌缺血大鼠的治療作用及其機(jī)制探討[J].皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2013,32(3):187-190.

[3] 陳奇.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法[M].北京:人民衛(wèi)生出版社, 2006.

[4] WANG R,MERCAITIS O P,JIA L,et al.Raf-1,actin dynamics,and abelson tyrosine kinase in human airway smooth muscle cells[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2013, 48(2):172-178.

[5] DAVIS R,PILLAI S,LAWRENCE N,et al.TNF-αmediated proliferation of vascular smooth muscle cells involvesRaf-1-mediatedinactivationofRband transcription of E2F1-regulated genes[J].Cell Cycle, 2012,11(1):109-118.

[6] CHAN S H,CHAN J Y,HSU K S,et al.Amelioration of centralcardiovascularregulatorydysfunctionby tropomyocin receptor kinase B in a mevinphos intoxication model of brain stem death[J].Br J Pharmacol,164(8): 2015-2028.

[7] 王雅娟,卞海,居靖,等.鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對(duì)心肌缺血大鼠血液黏度、血清AngⅡ和NO水平的影響[J].中成藥, 2013,35(5):1073-1075.

[8] 趙洪波.鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯的現(xiàn)代藥理研究與臨床應(yīng)用[J].中國(guó)藥物經(jīng)濟(jì)學(xué),2013,5(8):297-298.

[9] 孟云輝,吳艷霞,凃欣,等.鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血管緊張素Ⅱ、內(nèi)皮素的影響[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2006,11(5):550-552.

[10] 顧月珍,劉旭玲.高血壓病的辨證治療[J].黑龍江中醫(yī)藥,2007,2(2):27.

DOI 10.3870/yydb.2014.11.006

Effect of Zhengan Xifeng Decoction on Raf-1 mRNA and Protein Expression in Spontaneously Hypertensive Rats

XIE Xin,ZHANG Lin,CHEN Shi-yu,YANG Fang,ZHANG Li-de
(Teaching and Experiment Center,Liaoning University of Traditonal Chinese Medicine,Shenyang 110032,China)

ObjectiveTo study the effect of different doses ofZhengan xifengdecoction on Raf-1 mRNA and protein expression in the cardiovascular tissue of spontaneously hypertensive rats(SHR).MethodsA total of 50 male SHR,24 weeks old,were randomly divided into the model,low dose,medium dose,high dose ofZhengan xifengdecoction and the compound apocynum groups,10 in each group.Ten homologous male rats(WKY)served as the normal control group.After gavaged for 5 weeks,western blotting and RT-PCR were used to detect the Raf-1 protein and mRNA expression in the cardiovascular tissue,respectively.ResultsCompared with the model control group,both Raf-1 protein and mRNA expressions significantly increased in all treatment groups(P＜0.01).ConclusionTheZhengan xifengdecoction can stimulate cell proliferation and inhibit cell apoptosis by up-regulating the expression of Raf-1.

Zhengan xifengdecoction;Hypertension,spontaneous;Raf-1 mRNA

R286;R965

A

1004-0781(2014)11-1423-04

2013-09-03

2013-10-15

*遼寧省教育廳資助項(xiàng)目(2011164)

謝鑫(1982-),男,遼寧沈陽(yáng)人,講師,在讀博士,研究方向:中西醫(yī)結(jié)合治療心血管和原發(fā)性高血壓疾病。電話:024-31207016,E-mail:xieyanze2002@aliyun.com。

張立德(1960-),男,遼寧朝陽(yáng)人,教授,博士,研究方向:中西醫(yī)結(jié)合治療心血管和原發(fā)性高血壓疾病。E-mail:xieyanze2002@yahoo.com.cn。