松生等總黃酮提取工藝及鎮痛抗炎作用研究*

金巖,黃山,趙磊,裴小娜

[1.青島科技大學化工學院藥學系,青島 266042;2.甘肅中醫學院甘肅省高校中(藏)藥化學與質量研究省級重點實驗室,蘭州 730000]

松生等總黃酮提取工藝及鎮痛抗炎作用研究*

金巖1,黃山1,趙磊2,裴小娜1

[1.青島科技大學化工學院藥學系,青島 266042;2.甘肅中醫學院甘肅省高校中(藏)藥化學與質量研究省級重點實驗室,蘭州 730000]

目的 研究松生等總黃酮的最佳優化提取工藝,并對不同極性溶劑提取部分的鎮痛抗炎作用進行研究。方法通過單因素實驗和正交實驗,考察提取時間、料液比、乙醇濃度和提取次數對松生等總黃酮提取率的影響;采用小鼠冰醋酸扭體法及二甲苯致小鼠耳腫脹模型篩選松生等不同溶劑提取部分鎮痛抗炎作用。結果回流提取法提取松生等總黃酮的最佳條件為:提取時間3 h、料液比1∶30、乙醇濃度60%、提取2次,黃酮提取率最高5.63%;松生等乙醇提取物、正丁醇提取物和乙酸乙酯提取物均能夠抑制冰醋酸引起的小鼠扭體反應和二甲苯引起的小鼠耳腫脹。結論該工藝提取松生等總黃酮提取率高,方法簡便,重復性好。松生等乙醇提取物、正丁醇提取物和乙酸乙酯提取物均具有明顯鎮痛抗炎作用。

松生等;總黃酮;回流提取;鎮痛;抗炎

松生等(Euphorbia prolifera)為鼠李科植物西藏貓乳(Rhamnella gilgiticaMansf.et Melch.)或小葉鼠李(Rhamnus parvifoliaBunge)的干燥木材[1]。原植物主產于我國,主要分布在西藏東南部、云南西北部、四川西南部,為我國藏族傳統民間用藥,具有涼血、祛風濕、抗炎、消腫止痛功能,用于治療高山多血癥、麻風病等疾病。但目前對該藥研究較少,僅在20世紀90年代有少量文獻記載其主要成分為黃酮類化合物[2-3]。筆者在本實驗研究松生等總黃酮的最佳提取工藝,并通過冰醋酸誘導小鼠扭體實驗模型和二甲苯誘導小鼠耳腫脹模型比較不同溶劑提取部分的鎮痛抗炎作用。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物 實驗ICR小鼠,體質量(20±2)g,雌雄兼用,由青島藥物檢驗所提供,SPF級,生產許可證號:SCXK(魯)2009007,使用許可證號:SYXK(魯) 20092-009。

1.2 藥物與試劑 松生等采自西藏芒康地區,由成都中醫藥大學龍飛副教授鑒定為鼠李科貓乳屬植物西藏貓乳莖的干燥木質部;蘆丁對照品購自中國食品藥品檢定研究院(含量≥98%,批號:100080-200707);乙醇(天津博迪化工股份有限公司,分析純,批號: 20121019);冰醋酸(天津博迪化工股份有限公司,分析純,批號:20120524);二甲苯(天津市科密歐化學試劑有限公司,分析純,批號:20121103)。

1.3 儀器與設備 98-1-B型電子調溫電熱套(上海百申儀器設備有限公司);YP402N電子天平(北京京海正通科技有限公司);B-220恒溫水浴鍋(鄭州長城科工貿有限公司);P7021TP-6格蘭仕微波爐(廣東格蘭仕集團有限公司)。

2 方法與結果

2.1 總黃酮的含量測定

2.1.1 標準曲線的繪制 取105℃減壓干燥的蘆丁對照品11.7 mg精密稱定,乙醇溶解,定容至25 mL,搖勻,配成0.468 mg·mL-1蘆丁對照品溶液。分別量取此溶液1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL,置25 mL量瓶,分別加水6 mL,后加5%亞硝酸鈉1 mL,振搖后放置6 min,再加入10%硝酸鋁1 mL。搖勻后靜置6 min,最后加入4%氫氧化鈉10 mL,加水至刻度,搖勻,靜置15 min,在510 nm波長下測吸光度(UV-1000紫外可見分光光度計,北京萊伯泰科儀器有限公司)。以蘆丁濃度(μg·mL-1)為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線,得線性回歸方程為:A=12.759C-0.037 3,r= 0.999 5,表明蘆丁在18.72～93.60 μg·mL-1呈良好線性關系。

2.1.2 供試品溶液的制備 取干燥至恒重的松生等干燥物100 mg,精密稱定,置干燥小燒杯,加適量70%乙醇,加熱溶解。用濾膜過濾溶液并將其轉入25 mL量瓶,加超純水定容,搖勻,即得供試品溶液。

2.2 單因素分析

2.2.1 料液比對提取率的影響 稱取粉碎后的松生等5.0 g,以70%乙醇為提取劑,提取4 h,選擇料液比1∶20,1∶30,1∶40,1∶50條件下進行回流提取實驗,測定并計算相應條件下總黃酮得率,考察不同料液比對提取率的影響,結果見表1。

由表1可知,隨料液比中乙醇量增加,黃酮浸出率也依次增加,當料液比為1∶30(g·mL-1)時,達到最高,乙醇量繼續增加,黃酮浸出率有所下降,可能因為有大量雜質溶出,影響了黃酮浸出率,而且過大的料液比會造成溶劑和資源浪費,增加成本。綜合考慮,確定料液比1∶30為最佳料液比。

表1 不同料液比對提取率的影響Tab.1 Effect of the ratio of material to liquid on extraction rate

2.2.2 提取時間對提取率的影響 稱取粉碎后的松生等5.0 g,70%乙醇為提取劑,料液比為1∶30,提取時間分別為2,3,4,5 h,回流提取2次。研究不同提取時間對提取率的影響。見表2。

表2 提取時間對提取率的影響Tab.2 Effect of extraction time on extraction rate

由表2可知,提取率隨提取時間的延長出現先增加后逐漸降低的現象,當提取時間為4 h時達到最大值?？赡芤驗樗S酮物質已基本析出,延長提取時間不能使提取率升高。另外,延長提取時間致使環境溫度過高,部分乙醇溶劑揮發從而影響提取效果,因此選擇提取時間4 h最佳。

2.2.3 乙醇濃度對提取率的影響 稱取粉碎后的松生等5.0 g,料液比為1∶30,提取時間4 h,分別以50%,60%,70%,80%乙醇為提取溶劑進行回流提取實驗,提取2次。結果見表3。

結果表明,隨乙醇濃度增加,提取率先增加后減小,70%乙醇提取率最高,之后提取率下降,這可能是由于一些醇溶性雜質、親脂性強的成分溶出增多,干擾因素隨之增多,從而導致黃酮類化合物浸出率下降。所以最佳提取乙醇濃度為70%。

2.2.4 提取次數對提取率的影響 稱取粉碎后的松生等5.0 g,以70%乙醇為提取劑、提取時間4 h、液料比1∶30條件下進行回流提取實驗,測定并計算相應條件下總黃酮得率,考察提取次數對提取率的影響,結果見表4。

表3 乙醇濃度對提取率的影響Tab.3 Effect of ethanol concentration on extraction rate %

表4 提取次數對提取率的影響Tab.4 Effect of extraction times on extraction rate

2.3 正交實驗設計 根據上述單因素實驗結果,選擇料液比(A)、提取時間(B)、乙醇濃度(C)、提取次數(D)為考察因素,以總黃酮提取率為評價指標,采用L9(34)正交表對回流提取條件做進一步優選,因素水平見表5,實驗結果及方差分析見表6,7。

表5 正交實驗因素水平表Tab.5 Factors and levels of orthogonal test

由表6和表7可知,各因素對松生等總黃酮提取率影響順序為提取時間>料液比>提取次數>乙醇濃度,其中提取時間為最主要影響因素,各因素最佳組合為A2B2C1D2,即加入60%乙醇溶液,料液比為1∶30,回流提取2次,提取時間3 h,所得提取率最高。

表6 L9(34)正交實驗設計及結果Tab.6 Design and results of L9(34)orthogonal test

表7 正交實驗方差分析表Tab.7 Variance analysis on orthogonal test

驗證實驗:精密稱取松生等樣品5.0 g,2份,按照A2B2C1D2條件回流提取,測得松生等中總黃酮的提取率為5.62%和5.64%,平均提取率5.63%。

2.4 松生等不同極性提取物鎮痛抗炎作用研究

2.4.1 松生等不同極性提取物的制備 松生等去皮木部1 kg,75%乙醇3倍回流提取3次,濾過、回收乙醇提取液,得浸膏。將浸膏水溶液依次用乙酸乙酯、正丁醇進行萃取,直至萃取溶液無色為止,回收溶劑,即得不同溶劑的萃取物。

2.4.2 松生等不同提取物對冰醋酸所致小鼠扭體的影響 取小鼠40只,雌雄各半,體質量(20±2)g,隨機分為模型對照組、松生等乙醇提取物組、松生等正丁醇提取物組和松生等乙酸乙酯提取物組,每組10只。模型對照組每天給予0.9%氯化鈉溶液0.02 mL·g-1。其余各組每天分別給予等量松生等乙醇提取物、正丁醇提取物和乙酸乙酯提取物,連續灌胃3 d。末次給藥30 min后,每只小鼠腹腔注射0.6%醋酸0.02 mL·g-1,觀察10 min內扭體次數及扭體潛伏期,進行組間t檢驗[4]。見表8。

結果表明:松生等3種提取物與模型對照組比較,均差異有統計學意義,說明三者均有一定鎮痛作用。其中正丁醇提取物組和乙酸乙酯提取物組鎮痛效果略高于乙醇提取物組。

2.4.3 松生等不同提取物對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響 取小鼠40只,雌雄各半,體質量(20±2)g,隨機分為模型對照組、松生等乙醇提取物組、松生等正丁醇提取物組和松生等乙酸乙酯提取物組,每組10只。每組動物實驗前灌胃給藥,模型對照組給予0.9%氯化鈉溶液,0.02 mL·g-1,其余各組分別給予等量松生等乙醇提取物、正丁醇提取物和乙酸乙酯提取物,連續給藥5 d。末次給藥1 h后,每只小鼠右耳內外側涂二甲苯50 μL致炎,左耳不涂為正常耳對照,30 min后脫頸處死,沿耳廓基線剪下雙耳,用耳腫打孔器沖下左耳及右耳同一部位的圓片,立即在分析天平上稱質量,以兩耳片質量差作為腫脹度,進行組間差異性比較,計算耳廓腫脹率和腫脹抑制率。腫脹度(%)=(右耳質量-左耳質量)/左耳質量×100%[5];腫脹抑制率(%) =(模型對照組耳腫脹率-給藥組耳腫脹率)/模型對照組耳腫脹率×100%[5-6]。結果見表9。

實驗表明,松生等3種提取物給藥后均可以降低二甲苯致小鼠耳腫脹,與模型對照組比較,均差異有統計學意義,而組間差異無統計學意義,說明三者均有一定抗炎作用。其中乙醇提取物組抗炎效果略高于正丁醇提取物組和乙酸乙酯提取物組。

表8 4組小鼠鎮痛作用實驗結果Tab.8 Results of analgesia experiment on four groups of mice ±s

表8 4組小鼠鎮痛作用實驗結果Tab.8 Results of analgesia experiment on four groups of mice ±s

與模型對照組比較,*1P＜0.05,*2P＜0.01Compared with model group,*1P＜0.05,*2P＜0.01

組別小鼠/只劑量/(g·kg-1)潛伏期/min10 min內扭體/次鎮痛抑制率/%模型對照組10…7.62±2.0930.14±8.61…松生等乙酸乙酯提取物組105.854.79±1.35*111.21±7.52*263.49乙醇提取物組105.855.93±2.40*122.52±10.23*125.99正丁醇提取物組105.853.07±0.17*29.72±5.31*268.10

表9 松生等不同提取物對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響Tab.9 Effect of different extracts of Euphorbia prolifera on ear edema induced by xylene in mice ±s

表9 松生等不同提取物對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響Tab.9 Effect of different extracts of Euphorbia prolifera on ear edema induced by xylene in mice ±s

與模型對照組比較,*1P＜0.05,*2P＜0.01Compared with model group,*1P＜0.05,*2P＜0.01

組別小鼠/只劑量/ (g·kg-1)腫脹度/ mg腫脹抑制率/%模型對照組10…5.88±0.61…乙酸乙酯提取物組105.853.33±2.02*143.41乙醇提取物組105.852.62±1.12*255.44正丁醇提取物組105.853.70±1.04*237.12

3 討論

本研究采用乙醇回流提取法提取松生等總黃酮[7-9],通過單因素實驗考察了液料比、提取時間、乙醇濃度、提取次數對總黃酮提取率的影響,確定了正交實驗的4個水平。通過正交實驗及結果分析,可以得出各因素對松生等黃酮類化合物提取影響大小順序為提取時間>料液比>提取次數>乙醇濃度。最終確定的最佳提取工藝為A2B2C1D2。即加入60%乙醇溶液,料液比1∶40,回流提取2次,提取時間3 h最合適。采用本正交實驗優選的最佳工藝條件進行驗證,其提取率可達5.63%,表明該工藝重現性好,提取率高。

本實驗采用醋酸致小鼠扭體模型來觀察松生等黃酮提取物的鎮痛效果,其中松生等正丁醇提取物的疼痛控制率最高。松生等的主要有效成分為黃酮類化合物,對松生等黃酮類化合物的鎮痛作用筆者尚未見文獻報道。本研究在醋酸致小鼠扭體反應模型上,證明松生等黃酮提取物具有一定的鎮痛效果,這為臨床上使用松生等治療炎癥性疾病,緩解疼痛癥狀提供了實驗依據。但松生等提取物的鎮痛作用機制有待進一步研究。

炎癥是機體對組織損傷或致病因子侵入所產生的以防御為主的反應。作用在于殺滅微生物、清除異物和自身傷亡細胞或組織,以防止損傷擴大并促進受損組織修復[10]。本實驗通過觀察典型的二甲苯致炎小鼠耳廓腫脹模型證明了松生等提取物的抗炎作用。結果表明,松生等提取物對二甲苯致小鼠耳廓腫脹具有明顯的抑制作用。

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DOI 10.3870/yydb.2014.11.003

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Analgesia and Anti-inflammatory Effect of Total Flavonoids Extracted from Euphorbia prolifera

JIN Yan1,HUANG Shan1,ZHAO Lei2,PEI Xiao-na1
(1.Department of Pharmacy,Chemical EngineeringInstitute,Qingdao University of Science and Technology,Qingdao 266042,China;2.Key Laboratory of Chemistry and Quality for Traditional Chinese Medicines of the College of Gansu Province,Gansu College of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730000,China)

ObjectiveThe study aimed to investigate the best extraction process and the analgesia and antiinflammatory properties of total flavonoids fromEuphorbia prolifera.MethodsThrough single factor experiment and orthogonal test,factors that affect the extraction yield of total flavonoids were studied,including the extraction time,solid to liquid ratio, ethanol concentration and extraction times.The mice models of ear edema induced by xylene and twisting induced by acetic acid were used to evaluate the analgesia and anti-inflammatory effects of different extractions fromEuphorbia prolifera.ResultsTotal flavonoids were extracted by the refluxing method,and the optimum conditions were extracting for 3 hours,solid to liquid ratio of 1∶30,ethanol content of 60%in the solvent,and processed for 2 times.The highest extraction yield of total flavonoids fromEuphorbia proliferawas 5.63%.The ethanol,ethyl acetate and n-butanol extracts decreased twisting and ear swelling in mice.ConclusionThe extraction for total flavonoids fromEuphorbia proliferais simple,efficient and reproducible.The ethanol,ethyl acetate and n-butanol extracts of total flavonoids have obvious analgesia and anti-inflammatory effects.

Euphorbia prolifera;Total flavonoids;Reflux extraction;Analgesia;Anti-inflammation

R286;R965

A

1004-0781(2014)11-1411-05

2013-09-06

2013-10-25

*國家自然科學基金資助項目(81360686);甘肅省教育廳碩士生導師項目(1106-02)

金巖(1978-),女,山東青島人,講師,博士,從事天然藥物修飾及藥理活性研究。E-mail:qaz309@126.com。

趙磊(1967-),女,甘肅定西人,教授,博士,從事中藥化學研究。E-mail:luckleizhao@126.com。