左氧氟沙星4種晶型的大鼠體內藥動學研究*

吳媛媛,靳桂民,杜冠華,呂揚,戴貴東

(1.寧夏醫科大學藥學院藥理系,銀川 750001;2.北京協和醫學院、中國醫學科學院藥物研究所,北京100050)

左氧氟沙星4種晶型的大鼠體內藥動學研究*

吳媛媛1,靳桂民2,杜冠華2,呂揚2,戴貴東1

(1.寧夏醫科大學藥學院藥理系,銀川 750001;2.北京協和醫學院、中國醫學科學院藥物研究所,北京100050)

目的 研究左氧氟沙星4種晶型在SD大鼠體內藥動學差異,評價其優勢藥用晶型,探討藥物晶型物質狀態對臨床用藥的影響。方法SD大鼠灌胃給予不同晶型左氧氟沙星固體原料藥,高效液相色譜法測定血左氧氟沙星濃度,非房室模型計算大鼠體內藥動學參數并在不同晶型之間進行比對。結果大鼠灌胃給予左氧氟沙星晶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型后,血液中峰濃度(Cmax)分別為6.984,9.692,9.405,6.424 mg·L-1;達峰時間(tmax)分別為0.6,0.9,1.0,1.0 h;半衰期(t1/2)分別為4.207,2.970,4.857,1.695 h;藥-時曲線下面積(AUC(0→12h))分別為31.478,42.385,32.406,31.636 mg·h·L-1。結論大鼠口服不同晶型左氧氟沙星后,利用專業軟件DAS 3.0對測得的血藥濃度數據進行藥動學參數計算,左氧氟沙星4種晶型未發現差異有統計學意義,但檢測結果表明晶Ⅱ型血藥濃度最高,血藥濃度維持時間長,可能作為優勢藥用晶型用于產品生產。

左氧氟沙星;多晶型;藥動學;色譜法,高效液相

左氧氟沙星為第三代氟喹諾酮類抗菌藥物,是氧氟沙星(消旋體)中具有抗菌活性的S(-)型光學對映體,經拆分獲得的單一異構體(圖1),抗菌活性是氧氟沙星的2倍,不良反應發生率僅為氧氟沙星的1/3。其藥動學特征為血漿消除半衰期較長,在組織中分布廣泛,主要以原型從尿中排泄[1]。與氧氟沙星相比,具有抗菌譜廣、抗菌作用強等特點,在臨床上得到廣泛應用。《中華人民共和國藥典》2010年版二部收載了左氧氟沙星的質量標準[2]。

圖1 左氧氟沙星化學結構式Fig.1 Chemical structure formula of levofloxacin

近年來,藥物的多晶型已經成為國內外藥學領域的研究熱點[3-7]。固體化學物質多晶型現象(polymorphism),又稱同質異晶現象,是指由于分子結構的構型、構象、分子排列、分子作用力、共晶物質等各種因素影響,存在2種或多種分子排列狀態,形成不同的物質存在狀態[8]。固體藥物由于多晶型自由能之間差異以及分子間作用力不同,導致樣品的溶解度有差異,可造成藥物生物利用度不同,從而影響藥物在體內的吸收,產生藥效差異[9-10]。為研究不同左氧氟沙星晶型在大鼠體內的藥動學特征,探討左氧氟沙星不同晶型對口服吸收的影響,筆者在本實驗建立測定血漿左氧氟沙星濃度方法,同時探索大鼠灌胃左氧氟沙星4種晶型在體內吸收上的差異,并篩選出其中的優勢藥用晶型。

1 材料與儀器

1.1 試劑 左氧氟沙星4種晶型樣品(中國醫學科學院藥物研究所藥物晶型研究中心提供,純度均大于98%,批號:20130307),左氧氟沙星對照品(中國食品藥品檢定研究院,供含量測定用,批號:130455-201106),環丙沙星對照品(中國食品藥品檢定研究院,供含量測定用,批號:130451-201203)。甲醇、乙腈為色譜純,水為純化水,三乙胺、磷酸為分析純。

1.2 實驗動物 SPF級斯潑累格·多雷(Sprague Damley,SD)大鼠(♂),體質量(220±20)g,購自北京華阜康生物科技股份有限公司,合格證號:SCXK(京) 2009-0007。所有動物自由飲水及進食,自然照明,室溫19～21℃,預養2 d后進行實驗。

1.3 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀(二級管陣列檢測器,美國Agilent公司),Minispin離心機(德國Eppendorf公司),高速冷凍離心機(美國Backman公司),固體灌胃器(中國醫學科學院藥物研究所國家藥物篩選中心研制),N-EVAP-TM111型氮吹儀(北京康林公司)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent TC-C18(2) (150 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為乙腈-0.025%磷酸水溶液(三乙胺調pH=3.3)(13∶87);流速1 mL·min-1;柱溫35℃;進樣量20 μL;檢測波長299 nm;內標為環丙沙星。

2.2 對照品溶液及內標溶液的配制

2.2.1 對照品溶液的配制 取左氧氟沙星對照品適量精密稱定,用流動相溶解并配制成1.0 mg·mL-1溶液。以流動相為溶劑,將該溶液倍比稀釋成2.0,10, 25,50,100,250,500 μg·mL-1系列濃度對照品溶液,于4℃冰箱避光貯存備用。

2.2.2 內標溶液的配制 取環丙沙星對照品適量精密稱定,用流動相溶解并配制成1.0 mg·mL-1溶液。以流動相為溶劑,將該溶液稀釋成10 μg·mL-1內標溶液,于4℃冰箱避光貯存備用。

2.3 血漿樣品的處理

2.3.1 空白血漿的處理 取空白血漿200 μL,置于1.5 mLEP管,加入甲醇400 μL,振蕩混勻3 min,以13 400 r·min-1離心10 min,取全部上清液,氮氣(N2)吹干,加流動相100 μL復溶,振蕩混勻3 min, 13 400 r·min-1離心10 min,吸取上清液50 μL,用作HPLC分析。

2.3.2 血漿樣品處理方法 取血漿樣品150 μL,置1.5 mL離心管,加入內標溶液50 μL,渦旋混勻。然后按照“空白血漿處理方法”同法處理。

2.4 專屬性實驗 采用“2.3”項血漿樣品的處理方法,按“2.1”項色譜條件,對空白血漿(A)、空白血漿+左氧氟沙星(1 μg·mL-1)+環丙沙星(B)以及給藥后2 h的血漿樣品+環丙沙星樣品(C)進行測定。在設定條件下,血漿中的內源性物質不干擾左氧氟沙星和環丙沙星的測定,且左氧氟沙星與內標物分離度良好,說明該法具有良好的專屬性。HPLC分析結果見圖2。

2.5 標準曲線的繪制 取空白血漿180 μL,加入系列濃度的左氧氟沙星對照品溶液20 μL,配制成終濃度分別為0.2,1.0,2.5,5.0,10.0,25.0, 50.0 μg·mL-1血漿樣品,按“2.3”項血漿樣品的處理方法進行處理,利用對照品峰面積與內標峰面積比(Areas/Areai)對對照品濃度(C)作線性回歸(圖3),得出相應回歸方程為:Y=0.280 6X+0.036 2,R2= 0.999 8(n=5),表明左氧氟沙星血漿樣品在0.2～50.0 μg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.6 檢測限與定量限 以信噪比S/N=3作為最低檢測限,信噪比S/N=10作為最低定量限,結果本研究方法的檢測限為0.08μg·mL-1,定量限為0.2 μg·mL-1。

2.7 精密度實驗 取SD大鼠空白血漿180 μL,精密加入對照品溶液20 μL,使終濃度分別為0.2,2.5和10 μg·mL-1,然后分別加入內標工作液50 μL,按照“2.3”項血漿樣品的處理方法進行處理,用Areas/ Areai作為指標,考察日內和連續3 d(1 d內重復5次)的日間變異情況。結果顯示左氧氟沙星的日內和日間精密度良好(表1)。

2.8 回收率實驗

2.8.1 萃取回收率 取SD大鼠空白血漿180 μL,精密加入對照品溶液20 μL,使終濃度濃度分別為0.2, 2.5和10 μg·mL-1,然后分別加入內標工作液50 μL,按“2.3”項血漿樣品的處理方法進行處理,利用血漿樣品的峰面積與對照品峰面積比值,計算得出萃取回收率,重復5次,結果見表2。

A.空白血漿;B.空白血漿+左氧氟沙星+環丙沙星;C.給藥后2 h血漿+環丙沙星;1.左氧氟沙星;2.環丙沙星圖2 3種血漿樣品HPLC圖A.blank plasma;B.blank plasma spiked with levofloxacin and ciprofloxacin;C.blood sample at 2h from rat spiked with ciprofloxacin;1.levofloxacin;2.ciprofloxacinFig.2 HPLC chromatograms of three kinds of plasma sample

2.8.2 方法回收率 取SD大鼠空白血漿180 μL,精密加入對照品溶液20 μL,使終濃度濃度分別為0.2, 2.5和10 μg·mL-1,分別加入內標工作液50 μL,按“2.3”項血漿樣品的處理方法進行處理,利用血漿樣品的峰面積與內標峰面積的比值,代入線性方程,計算檢出量,檢出量與加入量的比值即為方法回收率,重復5次,結果見表2。

圖3 左氧氟沙星標準曲線Fig.3 Standard curves for Levofloxacin

左氧氟沙星萃取回收率均>90.0%,方法回收率均值102.3%,表明本研究采用的方法準確度良好。

2.9 左氧氟沙星不同晶型大鼠灌胃吸收實驗 將SD大鼠隨機編號并分為4組,每組6只,禁食12 h,按100 mg·kg-1給予左氧氟沙星不同晶型固體原料藥,于給藥后5 min,15 min,30 min,1 h,1.5 h,2 h,3 h, 4 h,6 h,8 h,10 h,12 h眼內眥靜脈取血約450 μL,加至預先加入肝素并低溫干燥的EP管,以5 000 r·min-1高速冷凍離心10 min,分離得到血漿樣品。按“2.3”項血漿樣品處理方法進行處理并進行分析。計算左氧氟沙星血濃度,繪制血藥濃度-時間曲線,結果見圖4。

表1 左氧氟沙星血漿樣品的日內和日間精密度Tab.1 Intra-day and inter-day precision for levofloxacin in plasma %,±s,n=5

表1 左氧氟沙星血漿樣品的日內和日間精密度Tab.1 Intra-day and inter-day precision for levofloxacin in plasma %,±s,n=5

加樣濃度/ (μg·mL-1)日間(n=5)回收率RSD日內(n=5)回收率RSD 0.2103.7±2.82.798.9±9.29.3 2.591.6±1.11.2102.2±4.64.5 1097.4±3.83.9102.6±4.03.9

表2 左氧氟沙星血漿樣品的回收率實驗結果Tab.2 Recovery of levofloxacin in plasma %,±s,n=5

表2 左氧氟沙星血漿樣品的回收率實驗結果Tab.2 Recovery of levofloxacin in plasma %,±s,n=5

加樣濃度/ (μg·mL-1)提取回收率回收率RSD方法回收率回收率RSD 0.299.4±3.23.2101.4±4.34.2 2.590.4±3.64.0106.5±5.45.1 1092.2±4.65.098.9±4.95.0

圖4 左氧氟沙星不同晶型的藥時曲線Fig.4 Plasma concentration-time profiles of levofloxacin polymorphs after administration(p.o.)of 100 mg·kg-1in rats(±s,n=6)

2.10 主要藥動學參數 利用專業軟件DAS 3.0對測得的血藥濃度數據計算藥動學參數(非房室模型法),主要參數結果見表3。研究發現,左氧氟沙星的4種晶型未發現差異有統計學意義,但檢測結果表明晶Ⅱ型血藥濃度最高,血藥濃度維持時間長,提示不同晶型物質可能有不同的臨床效果。

3 討論

與已有研究的給藥方式不同[11],本實驗采用了固體給藥方式,用大鼠固體灌胃器將不同晶型物質給予大鼠。此方法既避免了由于藥物混懸而造成的藥物晶型破壞,從而保證藥物以特定的晶型形式進入動物體內,又很好地模擬了固體口服藥物在生物體內的溶解釋放和吸收過程,因此是一種科學的晶型藥物給藥方式。樣品前處理方法與已有相關研究不同[12-14],筆者在本實驗使用了甲醇沉淀法,甲醇樣品經N2吹干濃縮,再用流動相復溶,該方法優點是回收率高、適用性強,操作簡便,且方法的精確度和準確度都符合有關規范要求。

已有研究發現藥物的不同晶型之間治療效果存在較大的差異[15-16],不同廠家生產的左氧氟沙星質量亦存在較大差異[17-20],其中藥物制劑生產過程中使用的原料藥缺乏多晶型的研究與質量控制是重要的影響因素。因此,提高仿制藥物的療效,必須重視藥物的物質狀態研究,通過篩選優勢藥物晶型來減小與專利藥的療效差異[18]。該研究結果可應用于左氧氟沙星固體制劑生產過程,對其原料藥進行晶型鑒定和晶型質量控制;對已上市的左氧氟沙星固體制劑應進行多晶型研究和藥品品質再評價。

本實驗建立了一種檢測大鼠血漿中左氧氟沙星濃度的高效液相色譜方法,并利用該方法對左氧氟沙星多晶型大鼠體內藥動學進行考察,盡管左氧氟沙星4種晶型的藥動學參數在統計學上并未發現差異有統計學意義,但實驗結果顯示4種晶型的一些區別,其中晶Ⅱ型作為優勢藥用晶型可能會在臨床上表現出更好的療效。

表3 左氧氟沙星多晶型在大鼠體內的血漿藥動學參數Tab.3 Pharmacokinetic parameters of levofloxacin polymorphs in plasma of rats ±s,n=5

表3 左氧氟沙星多晶型在大鼠體內的血漿藥動學參數Tab.3 Pharmacokinetic parameters of levofloxacin polymorphs in plasma of rats ±s,n=5

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DOI 10.3870/yydb.2014.11.002

Study on Pharmacokinetics of Levofloxacin Polymorphs in Rats

WU Yuan-yuan1,JIN Gui-min2,DU Guan-hua2,LYU Yang2,DAI Gui-dong1
(1.Department of Pharmacology, School of Pharmacy,Ningxia Medical University,Yinchuan 750001,China;2.Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Beijing 100050,China)

ObjectiveTo study the pharmacokinetics difference of levofloxacin polymorphs in rats,evaluate the advantageous medical polymorph,and explore the effects of different polymorphs on clinical medicine.MethodsFour crystal forms of levofloxacin were administered intragastrically to rats,and high performance liquid chromatography(HPLC)was used to measure the contents of levofloxacin in rat plasma.The pharmacokinetic parameters were calculated and comparedResultsAfter a single oral dose,the peak plasma concentration(Cmax)of crystal forms ofⅠ,Ⅱ,ⅢandⅣof levofloxacin was 6.984,9.692,9. 405,6.424 mg·L-1;the time to peak(tmax)was 0.6,0.9,1.0,1.0 h;the half-life(t1/2)was 4.207,2.97,4.857,1.695 h; the area under the curve(AUC0→12h)was 31.478,42.385,32.406,31.636 mg·h·L-1.ConclusionThere is no statistically significant difference in pharmacokinetic parameters.However,compared with other crystal forms,plasma concentration of crystal form II is higher and maintained longer.Therefore,crystal form II of levofloxacin is an advantageous polymorph for medicine.

Levofloxacin;Polymorphs;Pharmacokinetics;HPLC

R978.1;R965

A

1004-0781(2014)11-1407-05

2014-03-26

2014-04-27

*重大新藥創制十二五規劃項目(2012ZX09301002-001-013,2013ZX09102110);衛生部行業基金(200902008)

吳媛媛(1979-),女,河北唐山人,在讀碩士,研究方向:藥理學。電話:010-84439596,E-mail:cser_mars@126. com。

杜冠華(1956-),男,山東滕州人,研究員,博士生導師,從事藥物發現、高通量藥物篩選、神經藥理學和心腦血管藥理學研究。電話:010-63165184,E-mail:dugh@imm.ac.cn。