西他沙星溶解度與表觀油水分配系數研究*

丁維明,李桂玲,蔡聰,王菊仙,楊信怡

(中國醫學科學院、北京協和醫學院醫藥生物技術研究所,北京 100050)

·藥物制劑與藥品質量控制·

西他沙星溶解度與表觀油水分配系數研究*

丁維明,李桂玲,蔡聰,王菊仙,楊信怡

(中國醫學科學院、北京協和醫學院醫藥生物技術研究所,北京 100050)

目的 測定西他沙星在不同溶劑中的溶解度以及表觀油水分配系數,為劑型研究和制備工藝提供依據。方法采用高效液相色譜(HPLC)法,Dikma Diamonsil C18(2)色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調節pH至2.4)∶乙腈=70∶30;柱溫:室溫;流速1.0 mL·min-1;檢測波長:295 nm;進樣量10 μL。考察西他沙星在pH為2.0,4.3,5.8,6.6,7.4,8.0,10.0,11.2磷酸鹽緩沖液中溶解度和表觀油水分配系數。結果在(37±2)℃條件下,西他沙星在水中的平衡溶解度為0.44 mg·mL-1,表觀油水分配系數(P)為0.23(lgP= -0.64);在不同pH磷酸鹽緩沖液中,西他沙星在pH 7.4的中性條件下溶解度最低,僅為0.13 mg·mL-1,表觀油水分配系數最大,在pH＞10及pH＜5.8,西他沙星平衡溶解度顯著增大,表觀油水分配系數相應減小。結論西他沙星難溶于水,脂溶性也較差,但在酸性和堿性條件下有較高的溶解度。

西他沙星;溶解度;表觀油水分配系數;色譜法,高效液相

西他沙星(sitafloxacin)為第4代氟喹諾酮類廣譜抗菌藥[1],對革蘭陽性、革蘭陰性和厭氧菌都具有抗菌活性,特別是對氟喹諾酮類耐藥菌株、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、青霉素不敏感肺炎鏈球菌、腸球菌也具有抗菌作用,抗厭氧菌作用與亞胺培南、甲硝唑相當。其口服片劑和細顆粒劑已于2008年在日本上市,用于治療敏感菌引起的各類感染以及嚴重難治性感染性疾病[2-5]。國內目前尚未有產品上市銷售。筆者建立適用于西他沙星理化性質研究的高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法,并對方法進行驗證。在此基礎上,對西他沙星在水中及不同pH磷酸鹽緩沖液中的溶解度和油水分配系數進行了測定,為西他沙星新型制劑的處方設計、工藝研究和穩定性考察提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(LC-20AD單元泵,CTO-20AC柱溫箱,SIL-20AC自動進樣器,SPD-M2A檢測器,DGU-20A排氣單元,LC Solution工作站,日本島津);UV-2450紫外分光光度計(日本島津);AE200天平[梅特勒托利多儀器(上海)有限公司];PHS-3D pH計(上海精密科學儀器有限公司)。

1.2 試藥 西他沙星(中國醫學科學院醫藥生物技術研究所自制,晶型為含有3/2結晶水的結晶性粉末,批號:20121023);磷酸二氫鉀(分析純,北京化工廠,批號:20120105);乙腈(色譜純,迪馬公司,批號: 122070);磷酸(分析純,北京化工廠,批號: 20071112)。

2 方法與結果

2.1 西他沙星的HPLC方法學

2.1.1 色譜條件 色譜柱:Dikma Diamonsil C18(2)柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調節pH至2.4)∶乙腈=70∶30;柱溫室溫;流速1.0 mL·min-1;檢測波長295 nm;進樣量10 μL。

2.1.2 檢測波長的選擇 稱取西他沙星適量,用流動相溶解并稀釋制成濃度約為1 mg·mL-1的溶液,于波長190～400 nm進行紫外掃描,結果顯示西他沙星溶液在295 nm有最大吸收,故選擇295 nm作為檢測波長。

2.1.3 專屬性實驗 稱取西他沙星適量,用流動相溶解并稀釋制成濃度約為0.1 mg·mL-1的溶液。按上述色譜條件進樣,記錄色譜圖;另分別取空白溶劑(流動相)和正辛醇飽和水,按上述條件進樣,記錄色譜圖。結果見圖1,可見西他沙星主峰的峰形良好,柱效較高,且溶劑對西他沙星的測定無干擾,專屬性良好。

2.1.4 重復性實驗 稱取西他沙星適量,用流動相溶解并稀釋制成濃度約為0.1 mg·mL-1溶液,精密量取10 μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,量取西他沙星主峰面積,連續進樣6次,考察其重復性。結果RSD為0.12%,表明方法的偏差較小,重復性較好。

2.1.5 線性關系考察 取西他沙星適量,精密稱定,用流動相溶解并稀釋制成1 mg·mL-1溶液,作為貯備液;分別精密量取貯備液適量,用流動相稀釋制成500,200,100,50,10 μg·mL-1的系列標準溶液。分別吸取上述各標準溶液10 μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,量取西他沙星主峰面積,以主峰面積(A)對濃度(C,μg·mL-1)進行線性回歸,得標準曲線方程:A= 49 147C-1 383.3(r=1.000,n=3)。結果表明,西他沙星在10～500 μg·mL-1濃度范圍內主峰面積與濃度之間線性關系良好。

2.1.6 回收率實驗 精密稱取西他沙星80,100, 120 mg,分別置于100 mL量瓶中,加流動相溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為低(80%)、中(100%)、高(120%)濃度的供試品溶液。分別吸取各供試品溶液10 μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,量取主峰面積,按標準曲線法計算供試品溶液中西他沙星含量,計算回收率。低、中、高3種濃度回收率分別為99.7%, 100.3%,97.0%,RSD為1.4%。

2.1.7 溶液穩定性 稱取西他沙星適量,用流動相溶解并稀釋制成濃度約為0.1 mg·mL-1的溶液,于室溫下放置,分別于0,2,4,6,8 h吸取10 μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,量取主峰面積,計算RSD。結果:供試品溶液于不同時間進樣的主峰面積RSD為0.2%,表明西他沙星溶液在室溫下放置8 h內穩定性良好。

2.1.8 檢出限與定量限 配制一定濃度的西他沙星溶液,逐級稀釋,分別進樣10 μL,記錄色譜圖,計算信噪比(S/N)(主峰峰高與基線噪聲的比值),以S/N≥3為檢出限,S/N≥10為定量限。結果西他沙星的定量限為5.0 ng,檢出限為1.5 ng。

2.2 近似溶解度 稱取研成細粉的西他沙星供試品,分別置于(25±2)℃一定容量的溶劑中,每隔5 min強力振搖30 s;觀察30 min內的溶解情況,如看不見溶質顆粒時,即判斷為完全溶解。西他沙星在各種溶劑中的近似溶解度結果見表1。

A.空白溶劑;B.正辛醇飽和水;C.西他沙星溶液;1.西他沙星圖1 西他沙星專屬性實驗HPLC圖譜A.blank solution;B.n-octanol-saturated water;C.sitafloxacin solution;1.sitafloxacinFig.1 HPLC of specificity test on sitafloxacin

表1 西他沙星在不同溶劑中的近似溶解度Tab.1 Approximate solubility of sitafloxacin in different solvents

2.3 平衡溶解度

2.3.1 水中溶解度 稱取過量的西他沙星,置具塞三角瓶中,向其中加入純化水5 mL,平行2份,分別置于(25±2)和(37±2)℃水浴中,振搖24 h以上使平衡,得到過飽和溶液。分別取兩個溫度下的過飽和溶液適量,用孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過,取續濾液10 μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,量取主峰面積。按標準曲線法計算樣品液濃度(即平衡溶解度)。結果西他沙星在(25±2)和(37±2)℃水中平衡溶解度分別為0.33和0.44 mg·mL-1。

2.3.2 不同pH磷酸鹽緩沖液中溶解度 配制pH分別為2.0,4.3,5.8,6.6,7.4,8.0,10.0,11.2的磷酸鹽緩沖液。分別稱取過量的西他沙星,以不同pH的磷酸鹽緩沖液為溶劑,按照上述“2.3.1”項下方法操作,計算(37±2)℃西他沙星在不同pH條件下的平衡溶解度,見圖2。結果顯示,西他沙星平衡溶解度在pH 7.4磷酸鹽緩沖液中最低,僅為0.13 mg·mL-1,在pH＞10及pH＜5.8的條件下平衡溶解度顯著增大。

圖2 西他沙星在不同pH磷酸鹽緩沖溶液中的平衡溶解度[(37±2)℃]Fig.2 Equilibrium solubility of sitafloxacin in different pH phosphate buffered solution[(37±2)℃]

2.4 表觀油水分配系數 精密稱取西他沙星適量,分別溶于正辛醇飽和的水以及被正辛醇飽和pH為2.0, 4.3,5.8,6.6,7.4,8.0,10.0,11.2的磷酸鹽緩沖液中,制成濃度約為0.1 mg·mL-1溶液,分別精密量取各溶液20 mL置具塞三角瓶中,然后相應加入被水及不同pH的磷酸鹽緩沖液飽和的正辛醇20 mL,充分混合,置(37±2)℃恒溫振蕩器中,振蕩24 h以上,靜置,取下層水液10 μL,注入HPLC儀,記錄色譜圖,量取主峰面積,按標準曲線法計算西他沙星濃度。按以下公式計算表觀油水分配系數(P):

其中P為樣品的正辛醇/水相分配系數;C0為初始時水相中西他沙星濃度;Cz為達平衡后水相中西他沙星濃度;V0為初始時水相體積;V為初始時正辛醇相體積。結果見表2。

表2 西他沙星在不同溶劑中的表觀油水分配系數Tab.2 Apparentoil/waterpartitioncoefficientof sitafloxacin in different solvents

3 討論

在參考相關文獻[6]基礎上,筆者對西他沙星的HPLC方法進行了色譜條件篩選和方法學驗證。結果顯示,建立的HPLC方法簡便、快速、靈敏、準確,可用于西他沙星的含量測定。但在實驗過程中發現西他沙星在強光照射條件下有降解產物產生,因此在溶解度和表觀油水分配系數測定的實驗過程中應避免強光照射。

西他沙星的臨床給藥劑型為口服固體制劑,而溶解度是影響其體外溶出和體內吸收的重要因素,因此測定西他沙星不同溫度和不同pH條件下的溶解度,可為劑型設計和工藝參數的確定提供理論依據,對于預測制劑的溶出情況及溶出介質的選擇也有一定意義。由本研究溶解度實驗結果可知,西他沙星在水中溶解度極低,溫度升高溶解度略有提高,但仍屬極微溶。然而,隨著溶液pH向酸堿兩端變化,西他沙星的溶解度迅速增大,在pH 2.0酸性條件下溶解度約為pH 7.4中性條件下的425倍,在pH 11.0堿性條件下溶解度約為pH 7.4中性條件下的744倍。藥物在溶劑中的溶解度是藥物分子和溶劑分子間相互作用的結果,大多數藥物為有機弱酸、弱堿及其鹽類,這些藥物受pH影響較大。有機弱酸性藥物隨著溶液pH升高其溶解度增大,有機弱堿類藥物隨著溶液pH下降而升高。西他沙星的分子結構中含有羧基和氨基基團,為兩性化合物,本研究中溶解度的測定結果符合其帶有酸性基團和堿性基團的特點。

油水分配系數可以反映藥物在體內吸收的速度和程度,只有具備適當的油水分配系數才能使藥物具有良好的吸收及較高的生物利用度。西他沙星在水中和不同pH磷酸鹽緩沖液中的表觀油水分配系數P均＜0,說明西他沙星的脂溶性低于水溶性;一般認為有一定的脂溶性且lgP值在-1～2范圍內藥物容易吸收,西他沙星在4.3＜pH＜10.0條件下lgP值在-1～2的范圍內,但脂溶性較差,因此推測西他沙星在人體胃腸道內吸收度一般。但有文獻報道西他沙星口服吸收良好,生物利用度可達84%～94%[1,3],對于以被動擴散機制吸收的藥物來說,脂溶性大的易于透過細胞膜,由pH支配未解離的分子型藥物比離子型藥物易于透過細胞膜,西他沙星實際體內生物利用度要優于理論推測的結果,推測西他沙星口服吸收過程中不僅通過被動擴散透過生物膜,很可能還有主動轉運的參與,具體吸收機制有待細胞水平的進一步研究。

[1] 雷妮,高嵩,陳衛東,等.西他沙星的藥理和臨床評價[J].中國臨床研究,2010,23(10):930-932.

[2] ANDERSON D L.Sitafloxacin hydrate for bacterial infections [J].Drugs Today(Barc),2008,44(7):489-501.

[3] 柴蕓,劉明亮.新氟喹諾酮類抗菌藥西他沙星[J].國外醫藥:抗生素分冊,2009,30(6):264-270.

[4] NAKASHIMA M,UEMATSU T,KOSUGE K,et al.Pharmacokinetics and tolerance of DU-6859a,a new fluoroquinolone, after single and multiple oral doses in healthy volunteers[J]. Antimicrob Agents Chemother,1995,39(1):170-174.

[5] 劉美,劉鑫榮.抗菌新藥西他沙星水合物[J].上海醫藥, 2010,31(3):122-124.

[6] 朱光宇.HPLC法測定西他沙星的含量及有關物質[J].安徽醫藥,2011,15(12):1512-1513.

DOI 10.3870/yydb.2014.10.028

Determination of Solubility and Apparent Oil/Water Partition Coefficient of Sitafloxacin

DING Wei-ming,LI Gui-ling,CAI Cong,WANG Ju-xian,YANG Xin-yi
(Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Science&Peking Union Medical College,Beijing 100050,China)

ObjectiveTo determine the solubility and apparent oil/water partition coefficient of sitafloxacin in different solvents.MethodsHigh performance liquid chromatography(HPLC)was used.The column was Dikma Diamonsil C18(2) (4.6 mm×250 mm,5 μm).The mobile phase was 0.05 mol·L-1KH2PO4solution(pH was adjusted with H3PO4to 2.4)-acetonitrile(70∶30).The column temperature was set at room temperature.The flow rate was 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was 295 nm and the injection volume was 10 μL.The solubility of sitafloxacin and the apparent oil/water partition coefficient at pH 2.0,4.3,5.8,6.6,7.4,8.0,10.0 and 11.2 were determined.ResultsThe equilibrium solubility of sitafloxacin in water was 0.44 mg·mL-1and the apparent oil/water partition coefficient was 0.23(lgP=-0.64)at(37±2)℃. Sitafloxacin has the lowest equilibrium solubility(0.13 mg·mL-1)and the highest apparent oil/water partition coefficient in pH7.4 buffer solution system.At pH＞10 and pH＜5.8,the solubility of sitafloxacin increased obviously and apparent oil/water partition coefficient decreased.ConclusionSitafloxacin is insoluble in water and also poorly soluble in oil,but its solubility could be improved significantly in acidic or alkaline solution.

Sitafloxacin;Solubility;Apparent oil/water partition coefficient;Chromatography,high performance liquid

R978

B

1004-0781(2014)10-1357-04

2013-09-02

2014-02-08

*中央級公益性科研院所基本科研業務費專項(IMBF201201)

丁維明(1981-),女,山東龍口人,助理研究員,碩士,研究方向:藥物新劑型的研究與開發。電話:010-63181951,E-mail:weimingding@sina.com。

李桂玲(1973-),女,安徽宿州人,研究員,碩士,研究方向:藥物新劑型的研究與開發。電話:010-63181951,E-mail:liguiling1999@163.com。