SOD1和PI3K/AKT信號轉導通路在丙泊酚防治兔脊髓缺血-再灌注損傷中的作用*

余奇勁,陶紅,楊云朝

(1.武漢大學人民醫院麻醉科,武漢 430060;2.武漢市第一醫院麻醉科,武漢 430022)

SOD1和PI3K/AKT信號轉導通路在丙泊酚防治兔脊髓缺血-再灌注損傷中的作用*

余奇勁1,陶紅1,楊云朝2

(1.武漢大學人民醫院麻醉科,武漢 430060;2.武漢市第一醫院麻醉科,武漢 430022)

目的 探討超氧化物歧化酶-1(SOD1)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/絲氨酸(蘇氨酸)蛋白激酶B(AKT)的信號轉導通路在缺血前后丙泊酚聯合運用防治兔脊髓缺血-再灌注損傷(SCIRI)中的作用。方法將60只日本大耳白兔(雄性)隨機均分為3組(n=20):假手術組(S組)、缺血-再灌注組(I/R組)和丙泊酚保護組(P組)。I/R組和P組阻斷腹主動脈40 min,再恢復其血流。P組于主動脈阻斷前10 min和再灌注即刻分別靜脈泵注丙泊酚30 mg·kg-1,其余兩組則在相同時間點給予相同容積0.9%氯化鈉溶液。3組動物分別于術后1,2,3,5,7 d均被隨機處死4只動物,取其脊髓組織的L3-L4段,分別采用酶聯免疫吸附測定(ELISA)法檢測SOD1活性,采用實時聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測SOD1、PI3K、AKT的mRNA的表達水平。結果3組動物脊髓組織SOD1活性變化:術后第1天,與S組比較,I/R組、P組SOD1活性均顯著增強(均P＜0.05);術后第2天,與S組比較,P組SOD1活性升高(P＜0.05),而I/R組則無明顯變化(P＞0.05);術后第3～7天,與S組比較,I/R組SOD1活性均顯著降低(均P＜0.05),而P組則無明顯變化(均P＞0.05)。利用線性回歸分析發現,脊髓組織SOD1、PI3K、AKT的mRNA表達變化與SOD1活性的變化呈正相關。結論缺血前和缺血后丙泊酚聯合運用可有效防治兔SCIRI,其作用機制可能與丙泊酚通過激活PI3K/AKT信號轉導通路,進而增強脊髓組織中SOD1的表達有關。

丙泊酚;脊髓;缺血-再灌注;超氧化物歧化酶

本課題組前期實驗研究表明[1-2],缺血前和缺血后聯合應用丙泊酚可顯著增強兔脊髓中超氧化物歧化酶-1(superoxide dismutase-1,SOD1)的活性,進而有效防治脊髓缺血-再灌注損傷(spinal cord ischemic reperfusion injury,SCIRI),但具體作用機制尚未完全清楚[3]。WANG等[4]研究大鼠腦缺血-再灌注發現,腹腔注射大劑量丙泊酚,可激活磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/絲氨酸(蘇氨酸)蛋白激酶B(serine/threonine protein kinase B,AKT)信號轉導通路,從而起到腦保護作用。此外,在心臟缺血-再灌注損傷中應用丙泊酚也可有效激活PI3K/AKT信號轉導通路,減輕心肌細胞內質網途徑凋亡,防治心臟缺血-再灌注損傷[5-6]。基于以上研究,本課題擬用兔脊髓缺血-再灌注模型,采用丙泊酚缺血前和缺血后聯合運用干預實驗,探討SOD1和PI3K/AKT信號轉導通路與丙泊酚防治脊髓缺血-再灌注損傷的關系。

1 材料與方法

1.1 動物 日本大耳白兔60只,普通級,體質量2.0～2.5 kg,雄性;質量合格證:NO.4200400243;動物使用許可證號:SCXK(鄂)2008-003,由武漢大學實驗動物研究所提供。全價營養顆粒飼料,定時喂料,每天2次,供應足夠清潔飲水。兔舍溫度維持16～29℃,相對濕度40%～70%,噪音＜60 dB。

1.2 儀器與試劑 DH140B型動物呼吸機(浙江醫療儀器廠),LIFESCOPE9型生理儀(日本光學有限公司),微量泵(英國Graseby公司),丙泊酚(商品名:得普利麻,英國阿斯利康公司,批號:JC843,規格: 20 mL∶200 mg],SOD1試劑盒(武漢華美生物工程有限公司,批號:CSB-EL022397RB)。

1.3 實驗動物分組 本實驗由武漢大學人民醫院動物研究機構審查委員會批準,按實驗室動物維護、使用的指導建議和要求處理動物。由實驗人員采取隨機數字表均分為3組:假手術組(S組),每組各20只。缺血-再灌注組(I/R組)和丙泊酚保護組(P組)。每組動物分別于術后1,2,3,5,7 d被處死,每個時間點均隨機處死4只。所有動物處死前均被安置在單獨的籠子里飼養,保證充足飲水、食物和良好的采光環境。

1.4 SCIRI模型的建立 靜脈留置針行耳緣靜脈穿刺,注入3%戊巴比妥鈉(戊巴比妥鈉300 mg溶于0.9%氯化鈉溶液10 mL)2 mL,經口氣管插管接呼吸機控制呼吸,頻率控制30次·min-1,呼吸比1.5∶1,二氧化碳分壓(PaCO2)維持在4.67～6.00 kPa。經耳緣靜脈輸注林格液10 mL·kg-1·h-1,間斷靜脈注射3%戊巴比妥鈉0.5mL·kg-1和維庫溴銨0.5 mg·kg-1維持麻醉。3 mg·kg-1肝素化后經右側股動脈插管,接生理儀連續監測股動脈壓和心電圖,保持血流動力學穩定。加熱墊維持直腸體溫在38℃。I/R組和P組通過阻斷主動脈創建SCIRI模型[4]:沿左肋邊緣下的豎脊肌旁縱行切開皮膚,分離裸露腹主動脈,于左腎動脈下1 cm水平以小直徑彈性硅膠管阻斷腹主動脈血流,使其動脈搏動消失,遠端平均動脈壓為0 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa),阻斷40 min后分別于再灌注后第1,2,3,5,7天處死動物,成功建立SCIRI模型。S組行腹主動脈分離,放置彈性硅膠管,不阻斷其血流。

1.5 丙泊酚干預 P組于主動脈阻斷前10 min和再灌注即刻分別以微量泵持續靜脈輸注丙泊酚30 mg·kg-1溶于0.9%氯化鈉溶液30 mL,輸注速度3 mL·min-1;而S組和I/R組在相應時間點則用微量泵以相同速度輸注0.9%氯化鈉溶液30 mL。所有動物在手術操作完畢縫合包扎并肌內注射青霉素40萬U,待動物清醒后拔出氣管導管,再歸籠飼養觀察。

1.6 標本的采集與保存 所有日本大耳白兔分別于術后第1,2,3,5,7天采取股動脈放血處死,迅速剝去背部皮毛,并用剪刀取L2～L6水平段脊椎,于冰器皿上取出脊髓組織,用刀片切去兩端損傷段脊髓,保留L3～L4水平段脊髓組織,用三蒸水清洗去污、迅速置入5 mL凍存管,液氮下快速冷凍,再轉-80℃冰箱凍存。

1.7 檢測指標

1.7.1 脊髓組織標本SOD1活性檢測方法 所有兔L3-4段脊髓新鮮組織,取100 mg用1×PBS洗去血污。剪成小塊放入組織研磨器(勻漿管)中,加入1×磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)1 mL制成勻漿,然后置于-20℃過夜;經過反復凍融2次處理破壞細胞膜后,將組織勻漿于2～8℃、5 000×g離心5 min;取適量上清液立即進行實驗,酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immuno-sorbent assay,ELISA)SOD1試劑盒進行檢測。

1.7.2 脊髓組織SOD1、PI3K、AKT的mRNA表達水平的測定 所有日本大耳白兔脊髓組織采用實時熒光定量法(real time polymerase chain reaction,RT-PCR)測定SOD1、PI3K、AKT的mRNA的表達水平。4種蛋白的引物核苷酸均由Invitrogen Biotechnology Co.,LTD中國公司合成(表1)。

RT-PCR操作步驟:①提取樣本總RNA,制成RNA溶液。取脊髓組織100 mg置入滲有Trizol Reagent 1 mL的勻漿器中充分研磨,加入三氯甲烷溶液250 μL充分混勻,靜置3 min;4℃于1 300×g離心8 min,取上清液于新的離心管中并加入0.8倍體積異丙醇混勻,-20℃放置15 min,4℃于1 300×g離心10 min,管底白色沉淀即為RNA;再通過洗滌、離心,加無RNA酶的水溶解RNA。②反轉錄。取RNA溶液2 μg置于PCR管中,加入1 μL的oligo(dT)15,再加入無核糖核酸酶的去離子水至12 μL,放入PCR儀上70℃保溫5 min,再迅速于冰上冷卻;依次加入5×PBS 4 μL,10 mmol·L-1dNTPs 2 μL,RNA抑制劑1 μL和反轉錄酶1 μL,用槍抽吸混勻;然后再放入PCR儀上42℃保溫30 min,后于80℃保溫5 min滅活反轉錄酶。③定量PCR。先取0.2 mL PCR管,配制反應體系,每個反轉錄產物配制3管;依次加2×qPCR Mix 12.5 μL、2.5 μmol·L-1基因引物2.0 μL(或2.5 μmol·L-1內標引物2.0 μL)、反轉錄產物2.0 μL、ddH2O 8.5 μL;再行PCR擴增,預變性95℃,1 min后,95℃,15 s;58℃,20 s;72℃,20 s;循環40次;末段延伸72℃,5 min,溶解曲線每20 s升溫1℃,由72℃升至95℃。④計算基因的表達量。根據ΔCt=CT目的基因-Ctβ-actin,△△Ct=△CT實驗-△CT對照,擴增倍數=2-△△CT計算目的基因與GAPDH相對表達量。

1.8 統計學方法 采用SPSS17.0版統計學軟件進行數據分析;所有計量資料以均數±標準差(±s)表示,組間同一時間點采用單因素方差分析;兩變量間采用線性回歸分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 脊髓組織SOD1活性檢測結果 3組動物同一時間點脊髓組織SOD1活性比較,術后第1天,與S組比較,I/R組、P組SOD1活性均明顯增強(P＜0.05);術后第2天,與S組比較,P組SOD1活性均升高(P＜0.05),而I/R組則無明顯變化(P＞0.05);術后第3天至第7天,與S組比較,I/R組SOD1活性顯著降低(P＜0.05),而P組則無明顯變化(P＞0.05)。見圖1。

2.2 實時熒光定量RT-PCR檢測結果

2.2.1 脊髓組織SOD1 mRNA的表達情況 3組動物同一時間點脊髓組織SOD1 mRNA的表達水平比較,術后第1天,與S組比較,I/R組、P組SOD1 mRNA的表達水平均增高(P＜0.05);與I/R組比較,P組SOD1 mRNA的表達水平顯著降低(P＜0.05);術后第2天,與S組比較,P組SOD1 mRNA的表達水平顯著升高(P＜0.05),I/R組則無明顯變化(P＞0.05);術后第3天至第7天,與S組比較,I/R組SOD1 mRNA的表達水平顯著降低(P＜0.05),而P組則無明顯變化(P＞0.05)。見圖2。

2.2.2 脊髓組織PI3K mRNA的表達情況 3組動物同一時間點脊髓組織PI3K mRNA的表達水平比較:①術后第1天,與S組比較,I/R組、P組PI3K mRNA的表達水平均增高(P＜0.05);②術后第2天,與S組、I/ R組比較,P組PI3K mRNA的表達水平明顯升高;③術后第3,5,7天,與S組比較,I/R組PI3K mRNA的表達水平顯著減低(P＜0.05),P組則無明顯變化(P＞0.05)(圖3)。

表1 測定SOD1、AKT、PI3K各mRNA表達水平所用核苷酸引物Tab.1 Nucleotide primers of SOD1mRNA、AKTmRNA、PI3KmRNA genes

與S組比較,*1P＜0.05;與I/R組比較,*2P＜0.05圖1 3組在不同時間的SOD1活性Compared with S group,*1P＜0.05;Compared with I/R group,*2P＜0.05Fig.1 SOD1 activity of three groups at different time points

與S組比較,*1P＜0.05;與I/R組比較,*2P＜0.05圖2 3組不同時間SOD1 mRNA的表達水平Compared with S group,*1P＜0.05;Compared with I/R group,*2P＜0.05Fig.2 SOD1 mRNA expression of three groups at different time points

與S組比較,*1P＜0.05;與I/R組比較,*2P＜0.05圖3 3組不同時間PI3K mRNA的表達水平Compared with S group,*1P＜0.05;Compared with I/R group,*2P＜0.05Fig.3 PI3K mRNA expression of three groups at different time points

2.2.3 脊髓組織AKT mRNA的表達情況 3組動物同一時間點脊髓組織AKT mRNA的表達水平比較,術后第1天,與S組比較,I/R組、P組AKT mRNA的表達水平均增高(P＜0.05);術后第2天,與S組、I/R組比較,P組AKT mRNA的表達水平明顯升高;術后第3至第7天,與S組比較,I/R組AKT mRNA的表達水平顯著減低(P＜0.05),P組則無明顯變化(P＞0.05)。見圖4。

與S組比較,*1P＜0.05;與I/R組比較,*2P＜0.05圖4 3組不同時間AKT mRNA的表達水平Compared with S group,*1P＜0.05;Compared with I/R group,*2P＜0.05Fig.4 AKT mRNA expression of three groups at different time points

2.3 相關分析 所有數據相對變化量為同一時間點某檢測指標均數減去該時間點S組的均數(如:術后第1天I/R組SOD1活性相對變化量=術后第1天I/R組SOD1活性的均數-術后第1天S組SOD1活性的均數)。利用術后不同時間點SOD1活性、SOD1 mRNA、AKT mRNA、PI3K mRNA相對變化量進行線性回歸分析,結果發現在I/R組、P組中,SOD1 mRNA、AKT mRNA、PI3K mRNA相對變化量與SOD1活性相對變化量均成正相關。I/R組中SOD1 mRNA相對變化量與SOD1活性相對變化量線性分析,r=0.98,P＜0.01; AKT mRNA相對變化量與SOD1活性相對變化量線性分析r=0.93,P=0.02;PI3K mRNA相對變化量與SOD1活性相對變化量線性分析r=0.90,P=0.03。P組中SOD1 mRNA相對變化量與SOD1活性相對變化量線性分析r=0.99,P＜0.01;AKT mRNA相對變化量與SOD1活性相對變化量線性分析r=0.99,P＜0.01; PI3K mRNA相對變化量與SOD1活性相對變化量線性分析r=0.96,P＜0.01。說明SOD1、AKT、PI3K的mRNA表達水平變化與SOD1活性的變化是一致的。

3 討論

PI3K/AKT信號轉導通路廣泛存在于生物體細胞內,具有細胞分化調節和抗細胞凋亡的作用,是許多細胞生命活動的關鍵信號轉導通路[7]。PI3K是由一個催化亞基p110和一個調節亞基p85共同組成,被激活后, PI3K的磷脂酰肌醇環上的3位羥基磷酸化,產生磷酸化的磷脂酰肌醇;磷酸化的磷脂酰肌醇再通過活化的磷酸肌醇依賴性激酶-1激活AKT,使之活化,進而激活或抑制下游靶蛋白,產生信號轉導通路的級聯反應[8-9]。

目前已有研究報道顯示,在腦、心臟等重要組織或器官缺血-再灌注損傷中,大劑量應用丙泊酚可激活組織細胞中PI3K/AKT信號轉導通路,起到有效的保護作用。本實驗采用實時熒光定量RT-PCR從基因水平上進行檢測,對其mRNA的相對變化量利用線性回歸分析,結果發現:3組動物脊髓組織中SOD1、AKT、PI3K的mRNA表達水平的變化趨勢與SOD1活性變化趨勢具有一致性,表明在兔SCIRI中PI3K/AKT信號轉導通路與SOD1活性變化緊密相關。同一時間點(術后第1,2天),與S組比較,P組PI3K、AKT的mRNA表達水平均顯著提高,說明缺血前和缺血后丙泊酚聯合運用可激活PI3K/AKT信號轉導通路。但在丙泊酚防治兔SCIRI的實驗中,究竟是由增強的SOD1活性激活了PI3K/AKT信號轉導通路,還是由激活的PI3K/AKT信號轉導通路增強了SOD1活性呢?

目前,已有大量細胞體外實驗表明,抗氧化藥物是通過激活PI3K/AKT信號轉導通路,進而上調SOD1或SOD2活性,起到抗氧化應激的作用,有效防治細胞DNA氧化損傷、線粒體功能障礙、神經細胞凋亡等作用[10-11]。因而,筆者推測缺血前和缺血后丙泊酚聯合運用也是通過先激活PI3K/AKT信號轉導通路,進而引起SOD1活性上調,有效清除脊髓組織中過多的活性氧自由基,從而有效保護脊髓神經元抗氧化損傷。

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DOI 10.3870/yydb.2014.10.005

Role of SOD1,PI3K/AKT Signaling Pathway in Protection of Propofol on Spinal Cord Ischemic Reperfusion Injury in Rabbit Model

YU Qi-jing1,TAO Hong1,YANG Yun-zhao2
(1.Department of Anesthesiology,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,China;2.Department of Anesthesiology,the First Hospital of Wuhan City,Wuhan 430022,China)

ObjectiveTo investigate roles of superoxide dismutase-1(SOD1),phosphatidylinositol 3-kinase(PI3K)/ serine/threonine protein kinase(AKT)signal transduction pathway in protection of propofol on spinal cord ischemic reperfusion injury(SCIRI)in rabbit model before and after ischemia.MethodsSixty Japanese male rabbits were randomly divided into 3 groups(n=20),namely sham-operation group(Group S),ischemia-reperfusion group(Group I/R)and ischemia-reperfusion group with propofol treatment(Group P).Abdominal aorta of the rabbits in group I/R and group P were blocked by clamp for 40 min and then the clamp was removed.Propofol(30 mg·kg-1)was intravenously infused 10 min before blocking the aorta and at the time of reperfusion.Normal saline was intravenously infused at the same time points in the other two groups.Four rabbits of each group were randomly executed 1,2,3,5,7 days after surgery.Spinal cord tissues at L3-L4levles were harvested.Bioactivity of SOD1 was detected by ELISA and mRNA expression levels of SOD1,PI3K and AKT were detected by RT-PCR.ResultsOn the 1st day after the surgery,the bioactivity of SOD1 increased significantly in Group I/R and Group P as compared with that in Group S(P＜0.05).On the 2nd day,compared with Group S,the bioactivity of SOD1 increased significantly in Group P(P＜0.05),but there was no change in Group I/R(P＞0.05).On the 3rd,the 5th and the 7th day,compared with Group S,the bioactivity of SOD1 decreased significantly in Group I/R(P＜0.05),but there was no change in Group P(P＞0.05).Linear regression analysis indicated that there was a positive correlation between the changes of SOD1 activity and the mRNA expression of SOD1,PI3K and AKT respectively in spinal cord tissues.ConclusionPre-and post-ischemic conditioning with propofolshows potent protective effects against SCIRI in the rabbit model.The mechanisms may be related to increased expression of SOD1 in the spinal cord tissues by activating PI3K/AKT signal transduction pathway.

Propofol;Spinal cord;Ischemia-reperfusion;Superoxide dismutase

R971.2;R965

A

1004-0781(2014)10-1273-05

2013-09-17

2014-02-07

*湖北省衛生廳青年人才基金項目(QJX2010-14)

余奇勁(1972-),男,湖北咸寧人,副主任醫師,碩士生導師,博士,研究方向:圍術期中樞神經功能調控與麻醉安危。電話:(0)13476053817,E-mail:yqj2566@sina.com。