磷濃度對銅綠微囊藻、大型溞和金魚藻三者相互作用的影響

馬劍敏 靳 萍，郭 萌，代克巖，徐婷婷，楊 程，藺慶偉

(1.河南師范大學生命科學學院，新鄉 453007;2.河南省環境污染控制重點實驗室，黃淮水環境與污染防治省部共建教育部重點實驗室，新鄉 453007)

富營養化已成為當今世界普遍面臨的水環境問題，它會影響水體中浮游植物和浮游動物種群的變化，從而改變生態系統的結構和功能［1-2］。藍藻水華的頻繁發生是富營養化淡水水體的一個主要表現，如何控制藍藻水華則成為現今的水體生態環境研究熱點［3］。經過多年理論研究和實踐達成共識，生態修復是長期有效的控制水華的最佳方式。而生態修復中有兩種重要而有效的措施:利用生物操縱［4］和大型水生植物來控制藻類［4-6］。

生物操縱是通過浮游動物的攝食(下行作用)，達到直接控制浮游植物的目的。一些研究發現［7-8］，以水溞等大型透明溞動物占優勢的湖泊中浮游植物生物量和生產力較低。而大型水生植物不僅能與浮游植物競爭營養、光照、空間等資源［9-10］，還能分泌化學物質抑制浮游植物的生長［11-12］。兩者相輔相成，最終獲得良好的抑藻效果。Benndorf最早提出了生物操縱的磷負荷閾值問題［13］，但不同學者對磷負荷閾值范圍的研究結果并不一致，有人認為該范圍為 0.05—0.15 mg/L［14］，有人認為是 0.25mg/L［15］，因此適用于我國水體的磷濃度條件需要進一步研究。不僅如此，當水體中的磷濃度超過某一限度后，以大型沉水植物為主的清潔型草型穩態就會轉化為以浮游植物為主的渾濁型藻型穩態的水生態系統［5］。且生物操縱能否有效和大型沉水植物能否恢復重建這兩者之間是有關聯的。所以磷濃度閾值是需要研究的關鍵。而之前我們也對這方面做了一些初步研究［16］，但研究尚不完善，有必要進一步研究在富營養化水體中實施生物操縱和恢復大型沉水植物所需的磷濃度。銅綠微囊藻是藍藻水華中占主要優勢的藻類，大型溞是牧食浮游植物的重要浮游動物，因此選擇銅綠微囊藻、大型溞和金魚藻為實驗材料，研究不同的磷濃度對三者相互作用的影響，為治理水華和恢復健康水體環境提供更多的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa，FACHB573)購自中國科學院水生生物研究所，保存在BG-11培養基中，培養條件為溫度25℃，光暗比14h∶10h，光強2000—3000lx。實驗前將其在BG-11培養基中馴化3次后擴大培養。進入對數生長期后，便可作為實驗接種藻種。

大型溞(Daphnia magna):實驗室內進行純化培養并進行實驗前的馴化(溫度 25℃，光強 2000—3000lx，光暗比14h∶10h)，使用同一母體繁殖三代以上的出生6—24h的幼齡期大型溞作為實驗對象。

金魚藻(Ceratophyllum demersum):采集于牧野湖，取回實驗室后用自來水清洗干凈，培養于BG-11培養基中，放在實驗室靠窗的實驗臺上。實驗時用蒸餾水清洗3遍，選取生長良好、長勢一致的長15cm的頂枝做實驗材料。

1.2 培養液的配制

以BG-11培養基［17］為基礎，根據之前的預實驗配制成11mg/L氮濃度下磷濃度梯度為0.2、0.5、1.0、1.5mg/L的培養液，然后用1mol/L NaOH調節pH到7.5;氮濃度的設置以重富營養化水質為參考，磷濃度則覆蓋從中度到重度富營養化水質的范圍。所有培養液及器皿均高壓滅菌。

1.3 實驗方法

1.3.1 接種方法

將經過擴大培養的銅綠微囊藻細胞接種于無氮無磷的BG-11培養液中饑餓培養2d，以去除藻細胞中蓄積的氮、磷，之后倒取適量藻液，4000r/min離心15min，棄去上清液，再用無菌蒸餾水洗滌2次，棄去上清液，以去除吸附性營養，最后稀釋成所需的藻細胞濃度。均為無菌操作。

1.3.2 銅綠微囊藻和大型溞共培養

在250mL的錐形瓶中加入150mL BG-11培養液及5個大型溞，然后加入不同體積的銅綠微囊藻藻液，每個銅綠微囊藻密度梯度設3個重復，培養10d，觀察大型溞的繁殖情況，以確定最適宜大型溞繁殖的藻細胞密度(表1)。經單因素方差分析，各密度組之間的大型溞數目差異著性(P＜0.05);最適宜藻細胞密度為1.48×105個/mL。

表1 大型溞在不同密度的銅綠微囊藻中培養時的數量變化Table 1 The quantitative change of D.magna cultured in different M.aeruginosa density

根據上述實驗所確定的適宜的銅綠微囊藻密度，在不同磷濃度梯度培養液的錐形瓶中，加入等量的銅綠微囊藻藻液調節成1.5×105個/mL的藻密度，放入5個形態相似的大型溞，置于光照培養箱內(25±1℃，14h ∶10h，2000—3000lx)培養 15d，每個磷濃度3個重復，每隔3d添加適量培養液。測定銅綠微囊藻密度和大型溞數目、以及各培養液中總氮和總磷的濃度，計算各指標的變化率，以確定不同磷濃度下各指標的變化趨勢。

1.3.3 金魚藻對銅綠微囊藻的化感作用

金魚藻種植水對銅綠微囊藻的化感作用:在不同磷濃度培養液的1000mL錐形瓶中，加入相同質量的金魚藻置于培養箱培養15d后，取出金魚藻，補充與改良的BG-11培養液相同的氮、磷，接種相同密度的銅綠微囊藻后再于培養箱中培養15d(25±1℃，14h ∶10h，2000—3000lx)，每個磷濃度設3 個重復，每隔3d添加適量培養液。以同樣條件下單獨培養的銅綠微囊藻為對照(3個重復)。測定藻細胞密度、以及各培養液中總氮和總磷的濃度，計算各指標的變化率。

金魚藻與銅綠微囊藻共培養:與上述化感實驗條件相同，讓金魚藻和銅綠微囊藻共培養，此外，再增加單獨培養的金魚藻作為對照(3個重復)。測定銅綠微囊藻密度和金魚藻生物量、以及各培養液中總氮和總磷的濃度，計算各指標的變化率。

1.3.4 銅綠微囊藻、大型溞和金魚藻三者共培養

在含不同磷濃度培養液的1000mL燒杯中，加入等量的銅綠微囊藻藻液調節成相同的藻密度，然后加入相同重量的金魚藻和5個形態相似的大型溞，置于培養箱內(25±1℃，14h ∶10h，2000—3000lx)培養15d，每個磷濃度設3個重復，每隔3d添加適量培養液。測定銅綠微囊藻密度、大型溞數目和金魚藻生物量、以及各培養液中總氮和總磷的濃度，計算各指標的變化率。

1.4 測定指標

銅綠微囊藻細胞密度:在分光度計上掃描銅綠微囊藻的藻液在400—800nm的吸光值，確定銅綠微囊藻最大吸收峰的波長為680nm(圖1)。以相同初始條件接種3瓶銅綠微囊藻，培養14d，每隔2d測定1次藻液的吸光值(OD)，并用血球計數板計數藻細胞，建立藻細胞密度與吸光值OD間的回歸方程:y=119.597x-2.107，式中x為吸光值(OD)，y為藻細胞密度(×106個/mL)，回歸系數 R2=0.993，P＜0.05，因此可以用OD值直接反應藻細胞密度。

圖1 銅綠微囊藻培養液在波長400—800nm下的吸光值掃描圖Fig.1 Absorbance scan of M.aeruginosa culture solution on 400—800 nm wavelength

大型溞數目:肉眼計數。

金魚藻生物量:用吸水紙吸取枝條上的多余水分后，用電子天平稱其鮮重。

總氮和總磷濃度:將培養液以4000r/min離心10min，取其上清液，按照標準方法測定［18］。

1.5 數據處理

用spss19.0進行作圖及統計分析。

2 結果和分析

2.1 銅綠微囊藻和大型溞共培養

圖2顯示:磷濃度為0.2mg/L時，銅綠微囊藻密度增加幅度較小，大型溞的增長率大于銅綠微囊藻，培養液較清澈;磷濃度大于0.2mg/L時，銅綠微囊藻密度急劇增加，培養液變為藍綠色。可見磷濃度為0.2mg/L時，大型溞對銅綠微囊藻具有顯著抑制作用(P＜0.05);隨著磷濃度增高，大型溞對銅綠微囊藻的抑制程度減弱 (P＜0.05)。

圖2 銅綠微囊藻和大型溞共培養時增長率變化情況Fig.2 The change of growth rate of M.aeruginosa and D.magna when they cultured together

2.2 金魚藻和銅綠微囊藻的相互作用

用金魚藻種植水培養銅綠微囊藻時(圖3)，隨著磷濃度的升高，銅綠微囊藻的增長率升高，但實驗組中銅綠微囊藻的增長率遠低于對照組(P＜0.05)。磷濃度為0.2mg/L時，實驗組的銅綠微囊藻的增長率很低，約為接種值的40%，可見磷濃度越低時金魚藻種植水對銅綠微囊藻的抑制效果越明顯。

金魚藻與銅綠微囊藻共培養時(圖3)，隨著磷濃度的增高，銅綠微囊藻的增長率逐漸增大，對照和實驗組的金魚藻增長率均逐漸減小，實驗組的金魚藻增長率顯著低于對照組(P＜0.05)，原因是微囊藻與金魚藻之間存在競爭，甚至存在化感作用。磷濃度為0.2mg/L時，金魚藻對銅綠微囊藻有較高的抑制作用，銅綠微囊藻的密度比起始降低了20%;磷濃度介于0.5—1.5mg/L時，金魚藻生物量明顯下降，而銅綠微囊藻受到的抑制作用減弱，其密度呈現正增長。對比圖3中微囊藻的增長率可以發現，金魚藻種植水的抑藻效果明顯小于兩者共培養時的抑藻效果，原因是:后者除了有化感作用外，還有金魚藻對銅綠微囊藻的競爭作用;此外，也可能是兩種條件下金魚藻分泌的抑藻物質的量有所不同，或抑藻物質進入水環境后隨時間延長效力下降所致。

圖3 銅綠微囊藻和金魚藻的增長率變化情況Fig.3 The change of M.aeruginosa and C.demersum growth rate on experiment

2.3 藻-溞-草共培養

結果表明(圖4，圖5):高氮濃度下，銅綠微囊藻密度一直保持負增長，且隨著磷濃度的增大，負增長趨勢逐漸增大。說明銅綠微囊藻的種群數量得到了顯著抑制(P＜0.05)。金魚藻生物量隨磷濃度的升高而減少，磷濃度為0.2mg/L時，其生物量增量顯著高于其他3個磷處理組(P＜0.05)。大型溞數目隨磷濃度的升高而增加，各濃度組之間存在顯著差異(P＜0.05)。

圖4 三者共培養時銅綠微囊藻和金魚藻的增長率變化Fig.4 The change of M.aeruginosa and C.demersum growth rate when M.aeruginosa，D.magnaand C.demersum cultured together

圖5 三者共培養時大型溞的增長率變化情況Fig.5 The change of D.magna growth rate when M.aeruginosa，D.magna and C.demersum cultured together

2.5 不同組合下共培養對培養液中氮磷的去除效果

由圖6可見:銅綠微囊藻和大型溞共培養時，4個磷濃度梯度間的除氮效果有顯著差異(P＜0.05)，氮去除率最高為45%;磷平均去除率在50%以上，磷濃度為0.2、0.5mg/L時去除率(約70%—80%)均高于其他兩個濃度。化感實驗時，磷濃度為0.5mg/L時的氮磷去除效果均高于其他3個濃度。銅綠微囊藻和金魚藻共培養時，隨著磷濃度的升高，磷去除率增大，最高可達到95%;4個磷濃度梯度間的除氮效果有顯著差異，對氮的去除率，在1.0mg/L磷濃度下，氮平均去除率均顯著高于其他磷濃度下的去除率(P＜0.05)。可見，銅綠微囊藻和金魚藻共存時的氮、磷去除效果和化感實驗時的去除效果完全不同。在三者共培養時，磷濃度為0.5mg/L時，對磷的去除率均顯著高于其他濃度(P＜0.05);隨著磷濃度升高，氮去除率增大，4個組之間除氮效果差異顯著(P＜0.05)。

圖6 水中總氮和總磷去除率Fig.6 Theremovalrate change oftotalnitrogen and total phosphorus

3 討論

本實驗清楚地表明了富營養化水體中生物操縱的效果會受到磷濃度以及N/P比的明顯影響。磷與銅綠微囊藻的生長關系密切，且水體中的磷濃度易受到人為因素的影響。本研究中，對于0.2、0.5、1.0和1.5mg/L的磷濃度，N/P比分別為55/1、22/1、11/1、7.3/1。實驗中，磷濃度升高時，銅綠微囊藻的增長率也隨之增大。沈宏等［19］的研究表明，微囊藻對磷的攝取存在積累性，微囊藻的生長取決于藻細胞內的磷濃度。因此隨著培養液中磷的不斷消耗，細胞內的磷含量增加，而低磷培養液首先出現磷限制，高磷培養液中的銅綠微囊藻密度逐漸超過低磷培養液，銅綠微囊藻的細胞增長率高于低磷培養液。陳國永等［20］也指出細胞內磷增加有利于銅綠微囊藻生長，藻體內的磷對細胞增殖有促進作用。

銅綠微囊藻和大型溞共培養時，兩者的種群數量均隨磷濃度的升高而增加。磷濃度為0.2mg/L時，銅綠微囊藻的增長相對于其它高磷濃度較為緩慢，且存在大型溞的攝食作用，藻的增長率更加減小，前者的增長率低于后者，因而大型溞在磷濃度為0.2mg/L時占優勢。這一結果和有的學者提出的生物操縱在0.05—0.15mg/L的磷濃度時有較好的抑藻效果［14］的結論接近，但范圍略大。表明生物操縱的效果的確與水體的磷負荷有密切關系。也直接反映許多學者的研究事實，大型浮游動物的攝食可短期內控制浮游植物生物量，卻不能長期有效控制藍藻水華的急速增加，不能維持生物操縱效果的穩定性和長期性。從氮磷比的角度看，磷的相對缺乏有利于大型溞控制藻。

銅綠微囊藻和金魚藻共培養時，磷濃度為0.2mg/L(N/P=55/1)時，金魚藻在競爭中占優勢，而銅綠微囊藻的生長受到抑制;當磷濃度大于0.2mg/L(N/P比為22/1—7.3/1)時，隨著磷濃度升高，銅綠微囊藻的種群數量增大，而金魚藻的增長率最低降到初始值的60%。在磷濃度為0.2mg/L時，金魚藻生長狀況最好，表明高磷濃度不利于金魚藻生長，與王珺等［21］的研究結果一致。原因是營養鹽濃度超過金魚藻抗逆能力時，嚴重影響金魚藻的生理活動，對金魚藻的生長產生脅迫現象，從而使它的抗逆性弱化。而隨著磷濃度的升高，銅綠微囊藻增長率增大，是因為磷濃度的增加對藻細胞的增長有促進作用;從氮磷比的角度分析，浮游植物與大型沉水植物競爭時，較高的氮磷比對大型沉水植物有利。金魚藻的生物量最大時，銅綠微囊藻的生長受到抑制，說明金魚藻通過對重要生態因子(光、空間、營養等)的競爭、以及向水中釋放化感物質［22］，從而抑制藻的生長。Scheffer等認為［15］，0.25mg/L以內的磷負荷下，淺水湖泊可以通過大型沉水植物固定營養物而維持清潔狀態，高于此濃度，浮游植物將會占據優勢。

三者共培養時，銅綠微囊藻和大型溞的增長率變化趨勢相反。在所有的磷濃度下(N/P比為55/1—7.3/1)，銅綠微囊藻均處于負增長狀態，金魚藻和大型溞處于正增長狀態，尤其是大型溞的增幅更為明顯。表明三者共培養時，銅綠微囊藻始終受到明顯的抑制，而大型溞和金魚藻則一直處于優勢。說明在藻-溞系統中，大型沉水植物的加入，可以提高浮游動物枝角類對水華藻類的控制效果。因為大型水生植物為浮游動物提供了良好的棲息場所，水生植物的光合作用，增加水體溶氧量，為浮游動物的生長和繁殖提供足夠的氧氣;大型沉水植物不僅同浮游植物競爭光照和營養，還可能分泌化感物質，從而抑制浮游植物的生長和發展［22］，使水體透明度提高，水質得到改善。反映了生態系統的復雜性和生物多樣性的提高，有利于增強大型沉水植物的競爭力和控制水華藻類的效果。生物操縱的開拓者Shapiro認為，生物操縱之后，必須恢復水生植被才能維持清水態湖泊生態系統［23］。許多研究也表明［24-25］，大型沉水植物可以有效地降低淺水湖泊中營養物質的含量，從而顯著提高富營養水體的水質，對氮、磷污染有明顯的凈化作用，可維持水體長期穩定于清澈狀態。實驗中氮磷去除率的結果也證明了這點。

綜上可見，生物操縱與水生植被重建同時進行是可以實現的。合理的生物操縱和重建大型水生植物相結合，可以有效的控制浮游植物的過量生長，凈化水體。

鑒于上述結論只是在實驗室內模擬自然水生態條件下研究的結果，與實際水體的復雜性還有很大的差距，其結論的實際應用效果還有待進一步的驗證。

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