保幼激素在昆蟲中的分子作用機理

金敏娜，林欣大

(中國計量學院生命科學學院，浙江省生物計量與檢驗檢疫重點實驗室，杭州 310018)

1 保幼激素(Juvenile Hormone，JH)及其受體

保幼激素(Juvenile Hormone，JH)是由昆蟲咽側體分泌的重要激素［1］，其主要功能包括保持幼蟲的特性、維持前胸腺和促進卵巢成熟，調控昆蟲的發育、變態和生殖等過程［2-4］。近年來隨著分子生物學的不斷發展，一些國內外研究團隊以果蠅(Drosophila melanogaster)、赤擬谷盜(Tribolium castaneum)和德國小蠊(Blattella germanica)等為研究對象，借助RNA干擾和蛋白互作等技術在JH受體鑒定、JH調控昆蟲胚后發育、生殖過程及JH與蛻皮激素(Ecd)的相互作用等方面做了大量的研究工作。例如，在紅椿(Pyrrhocoris apterus)中，JH可以阻止由Ecd引起的幼蟲變態，從而維持蛻皮后的幼蟲狀態。在沙蟋(Gryllus firmus)的研究中，發現JH與沙蟋的翅型分化有關。戴華國等還通過褐飛虱(Nilaparvata lugens)若蟲體背點滴保幼激素類似物烯蟲酯(Methoprene)來證實褐飛虱翅型分化的敏感期是3齡末4齡初［5］。但Daimon等在家蠶(Bombyx mori)的dimolting(mod)突變體(缺少P450環氧酶而不能合成JH)中，發現在2齡幼蟲過后仍能發育成為早熟蛹［6］。這個結果暗示家蠶早期低齡幼蟲對保幼激素缺失不敏感，因此，JH可能還有其他功能或作用機制［7］。

1.1 JH受體

了解保幼激素分子作用的機制，很大程度上受限于JH受體的鑒定。在過去的20多年里國內外研究者對JH受體的克隆與鑒定做了大量的實驗和研究［8-9］。

早在1986年Wilson等在Met突變體果蠅對JH抗性研究中，發現過量的JH處理可以誘導果蠅幼蟲生成假瘤(pseudotumor)，而Met突變體對這種誘導作用的耐受能力遠比正常果蠅強［10］。methoprenetolerant(Met)屬于bHLH-PAS轉錄因子基因家族［11-12］，在果蠅對保幼激素類似物烯蟲酯的抗性研究中，也有發現Met突變體對烯蟲酯的耐受能力比正常果蠅強［13］，并且Met突變體抑制烯蟲酯誘導功能的發揮，制約雌性果蠅卵黃發育。Miura等人研究表明JH能強烈而特異性地結合Met，并迅速誘導Met進行轉錄［14］。離體轉錄翻譯的果蠅Met與JHIII有生理水平上的親和力，反之JHIII也可以誘導Met進行轉錄、翻譯合成JH受體蛋白Met。以上結果表明Met是最有可能的JH受體。

然而Pursley等發現Met基因缺失的突變體果蠅除了產卵延后、生殖力下降以外，胚后發育一切正常，這就與Met作為JH受體應有的表型相矛盾的。進一步研究發現Met有一個旁系同源基因Germ cellexpressed(Gce)［15］。Met和 Gce具有部分的功能重疊性，Gce能明顯提高Met突變體對烯蟲酯的敏感性，只有兩個基因的雙突變體才會有致死性［16］，并且Gce與JHIII也有生理水平上的親和力［17］。此外，對赤擬谷盜Met基因進行RNA干擾發現化蛹提前而形成早熟蛹，這種表型與JH缺失的表型相似，也為Met是JH受體的說法提供有力的證據［18］。就目前而言，JH 受體包括 Met和 Gce［19-20］。

1.2 JH受體相關蛋白

在果蠅的研究中發現bHLH-PAS(basic Helix-Loop-Helix-Per/Arnt/Sim)與核受體(如Met和Gce)結合形成異源二聚體，作為主要成分參與保幼激素信號通路［19，21-22］。在伊蚊(Aedes)的研究中發現MET和cycle(CYC)都屬于bHLH-PAS轉錄因子，兩者結合形成的二聚體，再與bHLH-PAS轉錄激活物steroid receptor coactivator(SRC/FISC)結合形成MET/CYC/FISC聚合物，將JH信號傳遞給下游應答基因Kr-h1和 Hairy，從而引起幼蟲的生理反應［11］。Sang等猜想 MET可以招募不同的DNA結合域bHLH-PAS 來發揮作用［11］。

2 Kr-h1基因

JH從咽側體分泌后，與載體蛋白形成復合體，經血循環到達細胞核，與核受體(Met、Gce等)或相關復合物特異性結合，進而對JH信號進行轉換并啟動細胞內特定基因Krüppel-homolog 1(Kr-h1)轉錄，最終影響昆蟲生長發育和引起相關形態等的變化［23］。早在 1896年，Schuh等在果蠅中發現了Krüppel(Kr)基因，該基因編碼的蛋白是一類具有鋅指結構域的轉錄因子，并且通過原位雜交在果蠅基因組和真核生物中發現 Krüppel有多種同源基因(Krüppel-homologous gene)，經過克隆、分析及鑒定，結果顯示Krüppel-homologous gene具有調控果蠅生長發育的作用［24］。后來在果蠅研究中的表明Kr-h1基因參與JH信號傳導途徑，并發揮其生理功能。隨后鑒定了JH受體Met和Gce，并且發現Kr-h1處于它們的下游，從而逐步形成了JH-Met(協同Gce)-Krh1調控模式，開始了Kr-h1研究的新篇章，被廣泛應用于全變態和不全變態昆蟲的研究中。Kr-h1基因影響神經細胞分化，調控胚胎、蛻皮等發育過程，球菜葉蛾(Agrotis ipsilon)AiKr-h1基因與雄性幼蟲的性行為成熟密切相關，借助德國小蠊(Blattella germanica)Kr-h1基因，可以探索昆蟲不全變態發育和全變態發育的差異［25］。

近年來對Kr-h1的研究逐漸增多，除了家蠶、黑腹果蠅、蜜蜂(Apis mellifera)和赤擬谷盜之外，通過NCBI檢索還發現了瘧蚊(Anopheles gambiae)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)、致倦庫蚊(Culex quinquefasciatus)、紅火蚊(Solenopsis invicta)、擬暗果蠅(Drosophila pseudoobscura)、螞蟻(Camponotus floridanus)、吸血紅椿(Rhodnius prolixus)［23］、紅椿(Pyrrhocoris apterus)［23］、熊蜂(Bombus terrestris)、苜蓿切葉蜂(Megachile rotundata)、球菜夜蛾［26］等昆蟲均有 Kr-h1或 Kr-h1同源基因。

2.1 Kr-h1基因的結構

最早是從果蠅中分離出了Kr-h1的突變體等位基因，分別是kr-h2—kr-h5，發現這些基因都是蛹致死因子，與kr-h1并沒有互補關系，突變位點位于遠離Kr-hα啟動子或者在第一個內含子的起始端［27］。

早在1986年，Schun等人就提出Kr-h1翻譯后的氨基酸是一種含有2個Cys和2個His的鋅指結構，Kr-h1基因的原初轉錄產物存在可變剪接，主要有 3 種剪接產物:Kr-h1α、Kr-h1β 和 Kr-h1λ［24］。Krh1α和Kr-h1λ主要調控昆蟲的蛹期變態及幼蟲-蛹的過程［28］;而Kr-h1β在胚胎中含量極其豐富，在昆蟲的胚胎發育及卵-幼蟲的發育過程中起到主要調控作用［27，29］。現有研究表明Kr-h1蛋白是一種含C2H2鋅指結構的轉錄因子，處于保幼激素受體Met下游。根據NCBI上的信息，查詢結果顯示目前為止擁有完整的8個鋅指結構(Zn1—Zn8)的Kr-h1基因共有18個。將這18個Kr-h1基因和克隆的褐飛虱Krh1翻譯后進行氨基酸序列比對(圖1)，結果顯示8個鋅指結構保守性存在明顯差異，Zn1和Zn8的保守性較低，Zn2—Zn7的保守性相對較高。此外8個鋅指的長短差別很大，尤其是Zn4特別短，其次是Zn7(圖1)。

圖1 Kr-h1蛋白8個鋅指結構的系統發育分析Fig.1 Phylogenic analysis of 8 Zinc fingers from Kr-h1 protein

此外，還找到了兩個Kr-h1全長基因，分別是人頭虱(Pediculus humanus corporis)的PhcKr-h1基因和麗蠅蛹集金小蜂的(Nasonia vitripennis)NvKr-h1基因。將這兩個基因翻譯成氨基酸后與上述的19種Kr-h1蛋白進行比較分析，結果發現所有所有Kr-h1蛋白均有Zn4，因此猜想該鋅指的功能最為普遍，此外還發現人頭虱的Kr-h1蛋白除了Zn7外其余鋅指都有，而麗蠅蛹集金小蜂的Kr-h1蛋白只有Zn4和Zn7(圖2)。非常有意思的是人頭虱和麗蠅蛹集金小蜂都屬于寄生類昆蟲，所以推測Kr-h1基因的鋅指結構可能在這兩種昆蟲的長期進化過程中出現部分退化，表現出Kr-h1鋅指蛋白個數的缺失，從另一方面來說，也可能8個鋅指結構在結構上有一定的冗余性。總而言之，根據Kr-h1鋅指蛋白基因的分布情況分析不同物種Kr-h1的差異，有助于更清晰地了解該基因的結構功能與特點。

圖2 Kr-h1蛋白鋅指分布圖Fig.2 Zinc fingersdistribution of Kr-h1 proteins

2.2 Kr-h1基因的功能

研究發現，在果蠅［27］、赤擬谷盜［30］等全變態發育昆蟲的胚胎期和幼蟲期，Kr-h1基因胚胎發育和胚后幼蟲蛻皮發育過程中表達比較活躍，蛹期則幾乎消失或不表達。在西花薊馬(Frankiniella occidentalis)［31］、德國小蠊［32］等不全變態發育昆蟲中，Kr-h1基因在胚胎和早期若蟲期表達活躍，在若蟲末期表達非常低。因此在昆蟲成蟲即將形成的分界段，Kr-h1的表達非常低甚至消失，暗示該基因的主要功能發揮在胚胎及幼蟲(或若蟲)時期。

迄今為止有關Kr-h1基因的功能研究主要集中在以下幾個方面:調控昆蟲生長發育、促進神經元細胞的形成以及影響蜜蜂的覓食行為和雄性球菜夜蛾的性行為成熟(表1)。

2.2.1 調控生長發育及變態

近年來，通過各種分子生物學手段探究該基因的功能。通過熒光定量PCR技術檢測Kr-h1在果蠅的胚胎及早期幼蟲生長發育階段的表達水平，結果顯示該基因的表達量在胚胎和幼蟲中表達量高，并且DmKr-h1在變態發育過程中起到重要的調控作用［27-28，33］。也有大量研究表明 DmKr-h1通過 JH 受體Met和Gce傳遞保幼激素信號，維持幼蟲形態，調控幼蟲的生長發育與變態［16，19］。

Hiroto等在家蠶(Bombyx mori)的研究中發現Kr-h1基因在家蠶的4齡末5齡初時期(V0)表達量很高，在5齡后1d(V1)時期表達量低下，在5齡后2d(V2)時期表達量更低［34］。隨著家蠶幼蟲的不斷發育，BmKr-h1的表達明顯下降，這說明BmKr-h1具有調控幼蟲生長發育的功能。有實驗者通過對赤擬谷盜和西花薊馬的研究來初步分析Kr-h1基因在完全變態發育和不完全變態發育兩類昆蟲中的功能［32］。赤擬谷盜的生長發育屬于完全變態發育，TcKr-h1的功能類似于DmKr-h1和BmKr-h1，起到調控胚胎發育、早期幼蟲生長發育及后期變態過程的作用［30，35］。西花薊馬Kr-h1在胚胎期轉錄水平非常高，幼蟲和前蛹期較低，蛹期則相當低，這表明FoKrh1可能在胚胎、幼蟲及蛹等階段起著調控作用［31］。

此外，不少研究者通過改變外源保幼激素或保幼類似物的濃度來處理家蠶早期幼蟲，引發幼蟲額外蛻皮形成超齡幼蟲或提前成熟化蛹［28］。從分子水平上來說，家蠶的這些形態變化與Kr-h1的變化有關，即Kr-h1的表達水平在一定程度上決定了幼蟲的蛻皮與變態發育。用吡丙醚(pyriproxyfen)處理家蠶幼蟲，前蛹和早期蛹雖然能發育成蛹但最終死亡［31］。利用RNAi技術將德國小蠊倒數第二齡或第三齡若蟲的Kr-h1表達水平下調，結果導致早熟成蟲的形成［32，36］。

表1 Kr-h1基因的功能Table 1 Function ofKr-h1 gene

在褐飛虱的Kr-h1研究中發現，NlKr-h1在胚胎、1齡及2齡若蟲中的表達量相對較高(Jin等未發表資料)。利用RNAi技術將3齡若蟲的 NlKr-h1沉默，結果發現成蟲的足、翅和生殖器發育明顯異常。此外NlKr-h1在大腦、翅、中腸及卵巢中表達活躍，推測NlKr-h1在胚胎發育、若蟲生長及成蟲成熟具有重要的調控作用。

2.2.2 促進神經元細胞形成

有研究表明，Kr-h1參與果蠅幼體神經系統發育，促使光感受器的發育和成熟［37］。在果蠅幼體的蘑菇體神經元細胞中，無論是處于初始分化階段還是神經突形成階段，DmKr-h1表達量均下調，這表明神經元形態發生時期DmKr-h1表達下調為其正常發育所需［37］。Duportets等人在球菜夜蛾雄性蟲體的研究中發現，AiKr-h1在不同組織中均有不同程度的表達，其中在腿部、胸部、大腦、觸角葉中的表達量比觸角、翅膀及腹部中高，尤其在腦部表達較高，因此懷疑AiKr-h1與幼體神經元形成有一定聯系［26］。

2.2.3 影響行為

Fussnecker等研究發現Kr-h1基因也與蜜蜂的覓食行為有關［40］。AmKr-h1在蜜蜂的腦部大量表達。工蜂是主要覓食群體，通過熒光定量PCR檢測到工蜂體內AmKr-h1的表達水平遠高于生育蜂群。研究結果表明AmKr-h1啟動子有應答大腦中cGMP信號傳導的元件，AmKr-h1基因影響cGMP介導蛋白激酶 G(Protein Kinase G，PKG)的激活［42］。有意思的是，Duportets等的研究發現AiKr-h1可能與雄性球菜夜蛾的性行為成熟有關［26］。

2.3 Kr-h1基因的調控

2.3.1 JH或JH類似物(JHA)對Kr-h1表達的影響

近年來國內外研究者們紛紛表明JH可能通過JH受體基因Met及其下游基因Kr-h1發揮其維持幼蟲形態或抑制變態的作用［31，39，42-45］。用 JH 及 JHA處理家蠶幼蟲，并通過qPCR檢測不同齡期幼蟲體內BmKr-h1的表達水平，結果發現當JH或JHA濃度增加，將引起家蠶幼蟲額外蛻皮而形成超齡幼蟲;若人為降低保幼激素含量，則會導致幼蟲提前化蛹，即“小”蛹。此外關于果蠅和赤擬谷盜JH信號通路的研究中，證實Kr-h1是一種重要的JH信號傳遞介質，并且隨著JH的變化而影響轉錄水平［45-46］。

用JHA和對照組丙酮(Acetone)處理家蠶幼蟲V3(5齡后3d的幼蟲)，結果發現Kr-h1的表達量在JHA處理后的V3體內與V0時期一樣高，而在丙酮處理后的V3體內表達量非常低，說明在JH存在的條件下家蠶Kr-h1基因仍能正常表達而不受齡期的影響［34］。用吡丙醚(Pyriproxifen)處理西花薊馬和捕食性薊馬(Haplothrips brevitubus)，結果表明吡丙醚可以誘導 Kr-h1的表達［31］。

因此，JH及JHA可以誘導Kr-h1基因表達，Krh1接收由JH受體Met傳遞的JH信號，調控其自身的轉錄表達。

3.3.2 Kr-h1上游調控元件

先前已經在云杉卷葉蛾(Choristoneura fumiferana)保幼激素酯酶(JH esterase)的啟動子(Promoter)區域發現了一個30 bp的保幼激素反應元件(CfJHRE)［47］。Kayukawa等對家蠶 Kr-h1基因的調控作了較深入的研究，發現在BmKr-h1上游2 kb附近有一個大小為141 bp的保幼激素應答元件kJHRE，該元件包含有一段CACGTG序列，稱之為E-box。bHLH-PAS家族轉錄因子BmMet2接受JH信號并與另一個bHLH-PAS家族轉錄因子BmSRC2作用形成二聚體(JH/BmMet2/BmSRC2)，從而 JH/BmMet2/BmSRC2定位在 kJHRE元件上，并激活BmKr-h1［46］。值得一提的是，結合已發表資料參考文獻［46］，通過序列比對發現，在果蠅、赤擬谷盜、蜜蜂、麗蠅蛹集金小蜂、豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)以及褐飛虱Kr-h1基因的上游均含有E-box(圖3)。其中目前研究發現TcKr-h1和AmKr-h1的E-box距離Kr-h1 啟動子比較近，而 BmKr-h1、ApKr-h1、DmKr-h1、NvKr-h1和NlKr-h1的E-box距離啟動子相對較遠。

3 Kr-h1與Broad complex(BrC)的互作關系

3.1 JH和Ecd的互作

圖3 Kr-h1基因的部分上游調控序列Fig.3 Partial sequence of Kr-h1 upstream region

JH和Ecd是調控昆蟲發育和變態的兩種最為重要的激素［48-49］，兩者之間相互作用、相互影響。Wang等人采用蛻皮激素和保幼激素類似物處理三眠蠶，結果用保幼激素類似物處理后的三眠蠶比正常的大，成為超齡幼蟲，而蛻皮激素處理后的三眠蠶提前蛻皮，繼而因不完全蛻皮致死［48］。有研究發現果蠅與家蠶和赤擬谷盜不同，外源保幼激素處理不能誘導幼蟲額外蛻皮形成超齡幼蟲，但持續給幼蟲喂食高濃度的保幼激素將導致預成蟲腹部發育異常［50］。JH可以通過調控或者抑制Ecd來影響昆蟲的變態發育過程［51］，所以說JH和Ecd是在昆蟲生長發育和成蟲發育時期的兩種重要信號傳遞者，調控昆蟲的生長發育、蛻皮及成蟲的成熟。

3.2 Kr-h1與Br的互作

Br(BrC)是蛻皮激素的轉錄因子基因，通過蛻皮激素受體復合物傳遞蛻皮信號至Br，引起該基因大量轉錄并促使幼蟲蛻皮或變態。Br在蛻皮激素信號傳導途徑中扮演著重要的角色，也是連接保幼激素與蛻皮激素信號通路的節點。

在果蠅的研究中發現JH通過Met和Gce傳遞信號，促使DmKr-h1基因表達上調，而DmKr-h1卻抑制 DmBr的表達［16］。家蠶的 BmKr-h1可以延遲Bombyx mori Br(BmBr)基因的表達，BmKr-h1對BmBr有抑制作用［31，52］。用吡丙醚處理西花薊馬和捕食性薊馬，研究結果發現吡丙醚可以誘導FoKr-h1的表達，而FoKr-h1抑制Frankliniella occidentalis Br(FoBr)的表達。FoKr-h1在胚胎、幼蟲及前蛹期均有不同程度的表達，直到蛹期才停止表達，而與此同時FoBr則進行大量轉錄和表達。遺憾的是，在薊馬中缺乏RNAi技術而未能進一步明確FoKr-h1和FoBr的功能［31］。

研究還發現赤擬谷盜Kr-h1和Br也有類似的相互作用機制［45，53］。TcKr-h1 在蛹期前均有表達，而蛹期后未見表達。通過RNA干擾等研究發現TcKr-h1是Tribolium castaneum Met(TcMet)下游基因，在蛹期TcMet的調控并由TcMet傳遞保幼激素信號，促使幼蟲維持形態。有意思的是，在保幼激素類似物Methoprene處理后，TcKr-h1與 Tribolium castaneum Br(TcBr)表達量出現了相反的趨勢，表現出TcKr-h1對TcBr基因的抑制作用。TcKr-h1是作為JH應答基因，在JH信號傳達途徑中聯系TcMet，并且對蛻皮激素信號傳導途徑中TcBr基因有抑制作用，因此TcKr-h1和TcBr可能是聯系保幼激素和蛻皮激素兩大信號通路的關鍵基因。

雖然在家蠶、黑腹果蠅及赤擬谷盜中Kr-h1對Br均有抑制作用(圖4)，但是這種說法尚待進一步研究明確，因此Kr-h1與Br在保幼激素和蛻皮激素信號傳導中的分子作用機制待進一步研究［50］。

圖4 Kr-h1(JH信號)和Br(Ecd信號)的互作關系Fig.4 Interaction between Kr-h1(JH signaling)and Br(Ecd signaling).

4 結論與展望

綜上所述，通過多方面、多角度地挖掘JH及其相關的分子研究:JH應答基因(反應元件)、JH受體鑒定及其相關蛋白研究、JH與Ecd的交互作用等，逐步了解轉錄因子Kr-h1的特性與功能。目前已經證實了JH是通過JH受體基因Met調控下游基因Kr-h1，并引起相應的生理學反應，當然在JH的這一信號通路中還涉及諸多蛋白或轉錄因子的協助。JH-Met-Kr-h1的調控模式是一個比較復雜的過程但是至少現在比較肯定的是Kr-h1可以傳遞保幼激素信號并調控昆蟲早期生長發育和變態。

總言之，Kr-h1的研究還有不少問題亟需回答。例如Kr-h1與Br如何搭建橋梁，連接JH和Ecd信號傳導途徑?上游保幼激素反應元件核心區域E-box與啟動子的距離，與Kr-h1的功能是否有關?有什么樣的關聯?Kr-h1和哪些相關基因形成緊密聯系的級聯反應?對Kr-h1的深入研究必將有助于我們更加清晰的了解JH作用的分子機制，相信在不遠的將來可以研制出更為安全的生物農藥，維護生態環境安全，同時也有助于解決農業害蟲危害造成的大量糧食損失問題。

［1］Hang Z J，Li Q R，Zhong Y J，Cao Y.Hormone adjustment of insect development by metamorphosis.Guangdong Sericulture，2004，38(2):42-45.

［2］Hiruma K， Kaneko Y. Hormonal regulation of insect metamorphosis with special reference to juvenile hormone biosynthesis.Current Topics in Developmental Biology，2013，103:73-100.

［3］Shelby J A，Madewell R，Moczek A P.Juvenile hormone mediates sexual dimorphism in horned beetles.Journal of Experimental Zoology Part B:Molecular and Developmental Evolution，2007，308(4):417-427.

［4］Riddiford L M，Truman J W，Mirth C K，Shen Y C.A role for juvenile hormone in the prepupal development of Drosophila melanogaster.Development，2010，137(7):1117-1126.

［5］Dai H G，Wu X Y，Wu S W.The change of juvenile hormone titer and its relation with wingdimorphism of brown planthopper，Nilaparvata lugens.Acta Entomologica Sinica，2001，44(1):27-32.

［6］Daimo T，Kozaki T，Niwa R，Kobayashi I，Furuta K，Namiki T，Uchino K，Banno Y，Katsuma S，Tamura T，Mita K，Sezutsu H，Nakayama M，Itoyama K，Shimada T，Shinoda T.Precocious metamorphosis in the juvenile hormone-deficient mutant of the silkworm，Bombyx mori.PLoS Genetics，2012，8(3):e1002486.

［7］Zhou S T，Guo W，Song J C.Molecular mechanisms of juvenile hormone action.Chinese Journal of Applied Entomology，2012，49(5):1087-1094.

［8］Judith H W.Regulating genes for metamophosis:concepts and results//Proceedings of the International Symposium on Molecular Insect Science.New York:Plenum Press，1990:91-98.

［9］Bajgar A，Jindra M，Dolezel D.Autonomous regulation of the insect gut by circadian genes acting downstream of juvenile hormone signaling.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2013，110(11):4416-4421.

［10］Wilson T G，Fabian J.A Drosophila melanogaster mutant resistant to a chemical analog of juvenile hormone.Developmental Biology，1986，118(1):190-201.

［11］Shin S W，Zou Z，Saha T T，Raikhel A S.bHLH-PAS heterodimer of methoprene-tolerant and Cycle mediates circadian expression of juvenile hormone-induced mosquito genes.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2012，109(41):16576-16581.

［12］Li M，Mead E A，Zhu J S.Heterodimer of two bHLH-PAS proteins mediates juvenile hormone-induced gene expression.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2011，108(2):638-643.

［13］Charles J P，Iwema T，Epa V C，Takaki K，Rynes J，Jindra M.Ligand-binding properties ofa juvenile hormone receptor，Methoprene-tolerant.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2011，108(52):21128-21133.

［14］Miura K，Oda M，Makita S，Chinzei Y.Characterization of the Drosophila Methoprene-tolerantgeneproduct.FEBS Journal，2005，272(5):1169-1178.

［15］Pursley S，Ashok M，Wilson T G.Intracellular localization and tissue specificity of the Methoprene-tolerant(Met)gene product in Drosophila melanogaster.InsectBiochemistry and Molecular Biology，2000，30(8/9):839-845.

［16］Abdou M A，He Q Y，Wen D，Zyaan O，Wang J，Xu J J，Baumann A A，Joseph J，Wilson T G，Li S，Wang J.Drosophila Met and Gce are partially redundant in transducing juvenile hormone action.Insect Biochemisty and Molecular Biology，2011，41(12):938-945.

［17］Baumann A，Fujiwara Y，Wilson T G.Evolutionary divergence of the paralogs Methoprene tolerant(Met)and germ cell expressed(gce)within the genus Drosophila.Journal of Insect Physiology，2010，56(10):1445-1455.

［18］Godlewski J，Wang S L，Wilson T G.Interaction of bHLH-PAS proteins involved in juvenile hormone reception in Drosophila.Biochemical and Biophysical Research Communications，2006，342(4):1305-1311.

［19］Bernardo T J，Dubrovsky E B.The Drosophila juvenile hormone receptor candidates methoprene-tolerant(MET)and germ cellexpressed(GCE)utilize a conserved LIXXL motif to bind the FTZ-F1 nuclear receptor.Journal of Biological Chemistry，2012，287(10):7821-7833.

［20］Abdou M，Peng C，Huang J H，Zyaan O，Wang S，Li S，Wang J.Wnt signaling cross-talks with JH signaling by suppressing Met and gce expression.PLoS One，2011，6(11):e26772.

［21］Lindebro M C，Poellinger L，Whitelaw M L.Protein-protein interaction via PAS domains:role of the PAS domain in positive and negative regulation of the bHLH/PAS dioxin receptor-Arnt transcription factor complex.EMBO Journal，1995，14(14):3528-3539.

［22］Travis J B，Edward B D.Molecular mechanisms of transcription activation by juvenile hormone:A critical role for bHLH-PAS and nuclear receptor proteins.Insects，2012，3(1):324-338.

［23］Jindra M，Palli S R，Riddiford L M.The juvenile hormone signaling pathway in insect development.Annual Review of Entomology，2013，58(1):181-204.

［24］Schuh R，Aicher W，Gaul U，C?te S，Preiss A，Maier D，Seifert E，Nauber U，Schuroder C，Kemler R，J?ckle H.A conserved family of nuclear proteins containing structural elements of the finger protein encoded by Krüppel，a Drosophila segmentation gene.Cell，1986，47(6):1025-1032.

［25］Huang J H，Lozano J，Belles X.Broad-complex functions in postembryonic development of the cockroach Blattella germanica shed new lighton the evolution ofinsectmetamorphosis.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-General Subjects，2013，1830(1):2178-2187.

［26］Duportets L，Bozzolan F，Abrieux A，Maria A，Gadenne C，Debernard S.The transcription factor Krüppel homolog 1 is linked to the juvenile hormone-dependent maturation of sexual behavior in themale moth，Agrotisipsilon.Generaland Comparative Endocrinology，2012，176(2):158-166.

［27］Beck Y，Pecasse F，Richards G.Krüppel-homolog is essential for the coordination of regulatory gene hierarchies in early Drosophila development.Developmental Biology，2004，268(1):64-75.

［28］Minakuchi C，Zhou X F，Riddiford L M.Krüppel homolog 1(Krh1)mediates juvenile hormone action during metamorphosis of Drosophila melanogaster.Mechanisms of Development，2008，125(1/2):91-105.

［29］Pecasse F，Beck Y，Ruiz C，Richards G.Krüppel-homolog，a stage-specific modulator of the prepupal ecdysone response，is essential for Drosophila metamorphosis.Developmental Biology，2000，221(1):53-67.

［30］Minakuchi C，Namiki T，Shinoda T.Krüppel homolog 1，an early juvenile hormone-response gene downstream ofMethoprenetolerant，mediates its anti-metamorphic action in the red flour beetle Tribolium castaneum.Developmental Biology，2009，325(2):341-350.

［31］Minakuchi C，Tanaka M，Miura K，Tanaka T.Developmental profile and hormonal regulation of the transcription factors broad and Krüppelhomolog 1 in hemimetabolous thrips.Insect Biochemisty and Molecular Biology，2011，41(2):125-134.

［32］Lozano J，Belles X.Conserved repressive function of Krüppel homolog 1 on insect metamorphosis in hemimetabolous and holometabolous species.Scientific Reports，2011，1:163-169.

［33］Benevolenskaya E V，Frolov M V，Birchler J A.Krüppel homolog(Kr-h)is a dosage-dependent modifier of gene expression in Drosophila.Genetical Research，2000，75(2):137-142.

［34］Hiroto M，Kakei M，Iwami M，Sakurai S.Hormonal regulation of the death commitment in programmed cell death of the silkworm anterior silk glands.Journal Insect Physiology，2012，58(12):1575-1581.

［35］Sheng Z T，Xu J Q，Bai H，Zhu F，Palli S R.Juvenile hormone regulates vitellogenin gene expression through insulin-like peptide signaling pathway in the red flour beetle，Tribolium castaneum.Journal of Biological Chemistry，2011，286(49):41924-41936.

［36］Belles X.Origin and evolution of insect metamorphosis//Encyclopedia of Life Sciences(ELS).Chichester:John Wiley＆Sons，Ltd.，2011.

［37］Fichelson P，Brigui A，Pichaud F.Orthodenticle and Krüppel homolog 1 regulate Drosophila photoreceptor maturation.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2012，109(20):7893-7898.

［38］Shi L，Lin S W，Grinberg Y，Beck Y，Grozinger C M，Robinson G E，Lee T.Roles of Drosophila Krüppel-homolog 1 in neuronal morphogenesis.Developmental Neurobiology，2007，67(12):1614-1626.

［39］Feyereisen R，Jindra M.The silkworm coming of age—early.PLoS Genetics，2012，8(3):e1002591.

［40］Fussnecker B，Grozinger C.Dissecting the role of Kr-h1 brain gene expression in foraging behaviorin honeybees(Apis mellifera).Insect Molecular Biology，2008，17(5):515-522.

［41］Martins J R，Nunes F，Cristino A S，Sim?es Z，Bitondi M.The four hexamerin genes in the honey bee:structure，molecular evolution and function deduced from expression patterns in queens，workers and drones.BMC Molecular Biology，2010，11:23-42.

［42］Shpigler H，Patch H M，Cohen M，Fan Y L，Grozinger C M，Bloch G.The transcription factor Krüppel homolog 1 is linked to hormone mediated social organization in bees.BMC Evolutionary Biology，2010，10:120-132.

［43］Zhang Z L，Xu J J，Sheng Z T，Sui Y P，Palli S R.Steroid receptor co-activator is required for juvenile hormone signal transduction through a bHLH-PAS transcription factor，methoprene tolerant.Journal of Biological Chemistry，2011，286(10):8437-8447.

［44］Jindra M，Charles J P，Iwema T，Iwema T，Epa V C，Takaki K，Konopova B，Smykal V，Rynes J.Signaling through the JH receptor Met and the repressor of metamorphosis Kr-h1 is common to insects//24th International Congress of Entomology.Daegu，2012.

［45］Parthasarathy R， Tan A J， Palli S R.bHLH-PAS family transcription factor methoprene-tolerant plays a key role in JH action in preventing the premature development of adult structures during larval-pupal metamorphosis.Mechanisms of Development，2008，125(7):601-616.

［46］Kayukawa T，Minakuchi C，Namiki T，Togawa T，Yoshiyama M，Kamimura M，Mita K，Imanishi S，Kiuchi M，Ishikawa Y，ShinodaT.Transcriptionalregulation ofjuvenile hormonemediated induction of Krüppel homolog 1，a repressor of insect metamorphosis.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2012，109(29):11729-11734.

［47］Kethidi D R，Perera S C，Zheng S，Feng Q L，Krell P，Retnakaran A，Palli S R.Identification and characterization of a juvenile hormone(JH)response region in the JH esterase gene from the spruce budworm，Choristoneura fumiferana.Journal of Biological Chemistry，2004，279(19):19634-19642.

［48］Wang H B，Ali S M，Moriyama M，Iwanaga M，Kawasaki H.20-hydroxyecdysone and juvenile hormone analog prevent precocious metamorphosis in recessive trimolter mutants of Bombyx mori.Insect Biochemistry and Molecular Biology，2012，42(2):102-108.

［49］Zera A J.Evolutionary geneticsofjuvenile hormone and ecdysteroid regulation in Gryllus:a case study in the microevolution of endocrine regulation.Comparative Biochemistry and Physiology Part A:Molecular ＆ Integrative Physiology，2006，144(3):365-379.

［50］Zhou X，Riddiford L M.Broad specifies pupal development and mediates the‘status quo’action of juvenile hormone on the pupal-adult transformation in Drosophila and Manduca.Development，2002，129(9):2259-2269.

［51］Ye G Y，Hu C，Gong H.Effects of juvenile hormone and ecdysteroid on ovarian development of the Japanese oak silkworm Antheraea yamamai.Journal of Zhejiang Agricultural University，1999，25(3):276-280.

［52］Piulachs M D，Pagone V，Bellés X.Key roles of the Broad-Complex gene in insect embryogenesis.Insect Biochemistry and Molecular Biology，2010，40(6):468-475.

［53］Suzuki Y，Truman J W，Riddiford L M.The role of Broad in the development of Tribolium castaneum:implications for the evolution of the holometabolous insect pupa.Development，2008，135(3):569-577.

參考文獻:

［1］黃志君，李慶榮，鐘仰進，曹陽.昆蟲變態發育的激素調控.廣東蠶業，2004，38(2):42-45.

［5］戴華國，吳曉毅，武淑文.褐飛虱體內保幼激素滴度變化及其與翅型分化的關系.昆蟲學報，2001，44(1):27-32.

［7］周樹堂，郭偉，宋佳晟.保幼激素的分子作用機制研究.應用昆蟲學報，2012，49(5):1087-1094.

［51］葉恭銀，胡萃，龔和.保幼激素和蛻皮激素對天蠶卵巢發育的影響.浙江農業大學學報，1999，25(3):276-280.