固定化脂肪酶合成蔗糖月桂酸酯的研究

李云凱，張志眾，程 磊

（唐山學院 環境與化學工程系，河北 唐山063000）

蔗糖脂肪酸酯簡稱蔗糖酯，指蔗糖與正羧酸反應生成的一大類有機化合物的總稱，由親水的蔗糖和親油的脂肪酸組成［1］。蔗糖月桂酸酯是蔗糖酯的一種，是極好的表面活性劑和乳化劑。它無嗅、無味、無毒和無刺激性，可100%生物降解，對環境友好，因此應用范圍極其廣泛［2］。傳統的蔗糖月桂酸酯產品多是采用化學法合成的，合成反應在高溫、高壓下進行，條件苛刻，終產物帶有顏色，同時發生多個平行反應，導致催化反應選擇性差，有副產物生成。而采用酶法合成蔗糖月桂酸酯，反應條件溫和，且區位選擇性和立體選擇性強，表面活性性質突出，具有很好的應用前景。

1 材料和方法

1．1 材料

蔗糖月桂酸單酯（美國Sigma公司生產），蔗糖月桂酸酯標樣（上海龍尼精細化工有限公司），蔗糖、月桂酸、DMSO（二甲基亞砜）、叔丁醇均為分析純，固定化脂肪酶采用包埋法自制。

1．2 方法

1．2．1 蔗糖月桂酸酯的酶促合成

在150 m L的錐形瓶中加入一定比例的蔗糖和月桂酸，加入5 mL DMSO／叔丁醇有機溶劑，再加入一定量的磷酸鹽緩沖液。預熱至50℃左右完全溶解，冷卻至室溫，加入固定化脂肪酶在搖床上振蕩10 min混勻。然后放置振蕩培養箱中繼續反應6 h，結束反應，檢測鑒定并計算產率。

1．2．2 轉化率的測定

結束反應，離心除去脂肪酶，用酚酞作為指示劑加入0．1 mol／L的NaOH中和反應體系中殘留的月桂酸，以月桂酸的減少量計算酯化率，結果以相對轉化率表示［3－4］：相對轉化率＝反應前后月桂酸物質的量的差值÷初始反應體系月桂酸的物質的量×100%。

2 結果與分析

2．1 月桂酸和蔗糖的摩爾比對酯化反應的影響

保持固定化脂肪酶的量一定，調節初始月桂酸與蔗糖的摩爾比為2∶1，4∶1，6∶1，8∶1，10∶1進行酯化反應，反應結束后計算相對轉化率，結果見圖1。

圖1 月桂酸與蔗糖摩爾比對酯化反應的影響

由圖1可知，當月桂酸與蔗糖的摩爾比小于2時，基本上沒有酯化反應發生；大于2時，隨摩爾比的增大，轉化率增加；摩爾比為8時能達到較高的轉化率，在90%左右，摩爾比大于8時轉化率變化平緩。因為酶催化的大部分反應是正逆反應速率都比較顯著的可逆反應，要使關鍵組分進行轉化，必須保持另一種物質的過量存在反應才能以較快的速度向正反應方向進行，當達到一定限度后，再增加過量組分的量，反應速率增加不再明顯，而且由于酶受空間位阻的影響反而有可能會使反應速率下降［5］。

2．2 固定化脂肪酶用量對酯化反應的影響

稱取固定化脂肪酶的用量為0．1 g，0．2 g，0．3 g，0．4 g，0．5 g，其他條件固定，置于恒溫振蕩培養箱中進行酯化反應，反應完成后測定酯化率，計算相對轉化率。

酶的濃度即用量的提高可以顯著縮短達到相同轉化率時所用的反應時間，但增加了生產成本，因此需要對轉化率和酶的用量進行優化。在其他條件不變的情況下，僅改變脂肪酶用量得到的相對轉化率如圖2所示。

圖2 脂肪酶用量對酯化反應的影響

由圖2可知，隨著酶用量的增加，蔗糖月桂酸酯的相對轉化率在一定范圍內呈線性方式增加，當酶用量達到0．3 g時相對轉化率達到91%，而后再提高酶濃度，發現轉化率幾乎維持不變，說明催化活性中心周圍不僅沒有足夠的底物進行反應反而造成了活性中心的“浪費”［6］。因而，當酶用量超過一定數值，相對轉化率反而有下降的趨勢，其原因可能是過量的酶吸附了反應過程中的溶劑，導致部分底物過飽和而析出，也可能是過量的酶加速了逆反應的進程即產物的分解，對轉化率產生了一定的影響。

2．3 溫度對酯化反應的影響

保持月桂酸、蔗糖及酶用量的比例不變，反應溫度分別設定為25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，反應結束后測定酯化率，計算相對轉化率，結果見圖3。

圖3 溫度對酯化反應的影響

由于酶的催化反應都存在最適的反應溫度，在此溫度范圍酶的催化反應速率達到最大，低于或高于此溫度反應速率都會下降，酯化反應的進程顯然會受影響。由圖3可以看出，在30℃時相對轉化率最大，而后隨著溫度的升高，轉化率明顯降低，說明此時酶的催化能力下降，該固定化脂肪酶的最適反應溫度為30℃。

2．4 緩沖液p H值對酯化反應的影響

嚴格配制p H 值分別為6．5，7．0，7．5，8．0，8．5的緩沖液，其他條件不變，在恒溫振蕩培養箱中進行酯化反應，反應結束后計算相對轉化率。結果見圖4。

圖4 緩沖液p H值對酯化反應的影響

維持正常的催化反應活性，酶要求其反應體系的p H值的大小有一定的范圍，同時，緩沖體系含有的定量的水對蔗糖分子存在形態有一定的影響。由圖4可知，當緩沖液的p H值增大時，相對轉化率呈現先增大后減小的趨勢，當p H為7．5時，相對轉化率最大，再增大緩沖液p H值，轉化率則會下降。說明固定化脂肪酶的催化活性有最適的p H值，體系p H值偏堿性使轉化率降低也可能是反應產物的水解加劇所致。

2．5 反應時間對酯化反應的影響

調節兩種反應物初始摩爾比8∶1，脂肪酶用量0．3 g，反應溫度設定在30℃，反應體系的p H調節為7．5。改變反應時間分別為2 h，4 h，6 h，8 h，10 h進行酯化反應，反應結束后計算相對轉化率。結果見圖5。

圖5 反應時間對酯化反應的影響

酶催化反應的反應時間要顯著小于使用化學催化劑時的反應時間，但時間太短也會使反應不夠完全，轉化率低，時間過長逆反應速率會增大使反應產物水解。由圖5可知，當反應時間小于6 h時，產物的轉化率一直在顯著的增大，說明反應過程是一個緩慢的進程，反應需要充足的時間，但反應超過6 h轉化率又有明顯的下降趨勢，說明生成的蔗糖月桂酸酯的水解速率加劇，產物減少。

2．6 固定化脂肪酶的重復活性測定

本實驗采用的脂肪酶是用包埋法自制的固定化脂肪酶，檢驗脂肪酶活性以便判斷其是否可以多次重復利用，以減小成本或者推廣到其他類似實驗中。固定其他條件均為最優條件，以脂肪酶催化的初始反應速率為指標對脂肪酶重復使用4次的數據進行分析。如圖6所示，隨著重復次數的增多，酶催化反應的初速率呈顯著下降趨勢，在使用3次后，酶的反應初速率從最初的0．234 mol／（L·min）下降到了0．13 mol／（L·min），下降近一倍，已不適合繼續進行催化反應，同時有解體的趨勢，故本實驗所用的催化劑的重復使用次數控制在2次以內為宜，超過2次則需更換新的催化劑。的吸收峰為羰基的伸縮振動吸收，1 113 cm－1是C－O－C的伸縮振動吸收，是酯的特征吸收峰。此外還有明顯的2 928 cm－1羥基的伸縮振動吸收和951 cm－1附近的糖苷鍵特征吸收，而且反應得到的產物和蔗糖月桂酸單酯標準品的紅外光譜圖的特征圖譜形狀基本相同，說明本實驗合成的產品是蔗糖月桂酸酯，得到的應該是單酯和多酯的混合物。

圖6 固定化酶的循環使用

圖7 蔗糖月桂酸酯的薄層色譜圖

圖8 反應物和產物的紅外光譜圖

2．7 產物的薄層色譜分析

圖7為蔗糖月桂酸酯的薄層色譜圖。圖右端有一系列的斑點，最下端為蔗糖月桂酸單酯，其與標準品的位置相對應，其他位置的斑點較淺，應該是產物中其他的脂肪酸酯混合物。

2．8 產物的紅外光譜分析

月桂酸、蔗糖月桂酸單酯標準品及產物的紅外光譜圖如圖8所示。由圖8可知，3 322 cm－1附近的峰為－OH的伸縮振動吸收，2 916 cm－1為CH 的伸縮振動吸收，1 450 cm－1處為DC－H伸縮振動吸收。提純的反應產物在1 738 cm－1處

3 結論

在有機相溶劑DMSO／叔丁醇體系中，以固定化脂肪酶為催化劑催化月桂酸與蔗糖的酯化反應，結果表明，當月桂酸與蔗糖的摩爾比大于8，反應溫度為30℃，固定化脂肪酶用量為0．3 g，緩沖液體系p H值為7．5，反應6 h時，酯化反應的相對轉化率較高，可達到90%以上。對自制的固定化脂肪酶重復活性測定結果表明，本催化劑重復使用次數控制在2次為宜。通過對有機溶劑提取的反應產物進行薄層色譜及紅外光譜分析，證實所合成的產物為蔗糖月桂酸酯。

［1］ 趙裕蓉，王寧玲．生物法制蔗糖酯──生物表面活性劑［J］．北京化工大學學報：自然科學報，1996，23（4）：6－10．

［2］ 李祖義，徐國梁，袁長貴，等．生物表面活性劑催化合成蔗糖酯及其應用［J］．上海化工，1999，24（21）：6－8．

［3］ 張軍，徐家立．固定化假絲酵母1619脂肪酶催化油酸油醇酯 的 合 成 ［J］．生 物 工 程 學 報，1995，11（4）：325－331．

［4］ 寇秀芬，徐家立．酶法合成糖及糖醇酯［J］．微生物學報，2000，40（2）：193－197．

［5］ Sarney D B，Kapeler H，Fregapane G，et al．Chemoenzymatic synthesis of disaccharide fatty acid esters［J］．J Am Oil Chem，1994，71（7）：711－714．

［6］ 譚賢勇．非水相酶法合成蔗糖－6－酯的研究［D］．南寧：廣西大學，2006．