瑤寶克癌靈膠囊抗腫瘤作用機(jī)制研究

趙成國，秦書芝，毛晶磊，吳麗艷，肖洪彬

1吉林大學(xué)珠海學(xué)院，廣東 珠海 519041；2大慶油田總醫(yī)院；3黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)

方 藥·藥理研究

瑤寶克癌靈膠囊抗腫瘤作用機(jī)制研究

趙成國1，秦書芝1，毛晶磊2，吳麗艷1，肖洪彬3△

1吉林大學(xué)珠海學(xué)院，廣東 珠海 519041；2大慶油田總醫(yī)院；3黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)

目的：從分子生物學(xué)角度探討瑤寶克癌靈膠囊抗腫瘤的作用機(jī)理。方法：采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)S180荷瘤小鼠外周血白細(xì)胞介素-2（IL-2）、γ-干擾素（IFN-γ）的含量；采用免疫組化法檢測(cè)凋亡相關(guān)基因突變型p53和Bcl-2基因的表達(dá)。結(jié)果：瑤寶克癌靈膠囊可明顯增加小鼠外周血IL-2、IFN-γ的含量，可抑制突變型基因p53和Bcl-2基因的表達(dá)。結(jié)論：瑤寶克癌靈膠囊抗腫瘤的作用機(jī)制可能與增強(qiáng)荷瘤小鼠免疫功能，抑制突變型基因p53和Bcl-2基因的表達(dá)有關(guān)。

瑤寶克癌靈膠囊；IL-2；IFN-γ；p53；Bcl-2

瑤寶克癌靈膠囊由救必應(yīng)、半邊蓮、夏枯草、了哥王等1 9味藥物組成，其中瑤藥6味，臨床上治療乳腺癌、乳腺纖維瘤、白血病、骨肉瘤及淋巴肉瘤效果明顯，尤其對(duì)乳腺腫瘤具有獨(dú)特的療效。本研究以瑤寶克癌靈膠囊為研究對(duì)象，從分子生物學(xué)水平探討瑤寶克癌靈膠囊的作用機(jī)制，為開發(fā)更為有效的治療腫瘤的中藥新藥和民族藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與瘤株 昆明種小白鼠（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供，合格證：黑動(dòng)字第P00101006號(hào)；發(fā)證單位：黑龍江省試驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)）；小鼠肉瘤S180（黑龍江省腫瘤醫(yī)院研究所提供，每7～10天腹腔傳代一次）。

1.2 藥品與試劑 瑤寶克癌靈膠囊（大慶德昆瑤醫(yī)提供）；環(huán)磷酰胺（CTX，上海華聯(lián)制藥有限公司，批號(hào)：050205）；小鼠TNF-α、小鼠IFN-γ以及小鼠IL-2定量ELISA檢測(cè)試劑盒均由上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司提供；p53、Bcl-2蛋白免疫組化染色試劑盒均由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 儀器 2010安圖酶標(biāo)儀（鄭州安圖生物技術(shù)有限公司提供）；RM2245組織切片機(jī)（LEICA德國提供）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠提供）；KDC-4 0低速離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司提供）；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司提供）；金怡牌H H-S恒溫水浴鍋（江蘇醫(yī)療儀器廠提供）。

1.4 方法

1.4.1 分組及給藥 小鼠50只右腋皮下接種S180瘤細(xì)胞懸液（l×107瘤細(xì)胞/mL）0.1mL/只，造模24小時(shí)后，荷瘤動(dòng)物按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為模型組、瑤寶克癌靈膠囊高劑量組（25.0g/kg）、瑤寶克癌靈膠囊中劑量組（12.5g/kg）、瑤寶克癌靈膠囊低劑量組（6.25/kg）、陽性對(duì)照組［CTX組，環(huán)磷酰胺30mg/kg（體質(zhì)量）］。各組均灌胃給藥，給藥體積為0.02mL/g，連續(xù)給藥14天。

1.4.2 標(biāo)本采集 停藥后次日摘取小鼠眼球取血，靜置l0分鐘，放入臺(tái)式低速離心機(jī)，2000rpm/min離心l0分鐘，分離血清，迅速放入冰箱-20℃保存，待測(cè)血清IFN-γ、IL-2［1］；脫頸椎處死小鼠，剝離瘤組織，10%甲醛固定，采用免疫組化法檢測(cè)p53、Bcl-2蛋白。免疫組化判斷標(biāo)準(zhǔn)：免疫組化陽性著色為棕黃色，p53蛋白主要位于細(xì)胞核，檢測(cè)結(jié)果作半定量處理，無著色計(jì)0分、淺黃色計(jì)1分、棕黃色計(jì)2分、棕褐色計(jì)3分。按陽性細(xì)胞數(shù)占整個(gè)腫瘤細(xì)胞的百分比例評(píng)分：取10個(gè)高倍視野，每個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算其平均數(shù)，≤25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～7 5%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分。以上2項(xiàng)相加，≤2分為（-），3分為弱陽性（+），4分為中度陽性（++），≥5分為強(qiáng)陽性（+++）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料以）表示，采用t檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用R i d i t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.0 5。

2 結(jié)果

2.1 瑤寶克癌靈膠囊對(duì)荷瘤小鼠血清IFN-γ含量的影響 瑤寶克癌靈膠囊高、中、低劑量組及環(huán)磷酰胺組同模型組比較，小鼠血清γ-IFN水平均有不同程度的提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 瑤寶克癌靈膠囊對(duì)S180荷瘤小鼠血清IFN-γ含量的影響

2.2 瑤寶克癌靈膠囊對(duì)荷瘤小鼠血清IL-2含量的影響 瑤寶克癌靈膠囊高、中、低劑量組同模型組比較，小鼠血清I L-2水平均有不同程度的提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0 1），環(huán)磷酰胺組同模型組比較無明顯差異（P＞0.0 5），見表2。

表2 瑤寶克癌靈膠囊對(duì)S180荷瘤小鼠血清IL-2含量的影響

2.3 瑤寶克癌靈膠囊對(duì)荷瘤小鼠p53、Bcl-2蛋白表達(dá)水平的影響 各組突變型p53均有不同程度的表達(dá)，其中模型組突變p53蛋白高表達(dá)，各給藥組也有不同程度的表達(dá)，但較模型組表達(dá)有所減弱，其中高劑量組同模型組比較有顯著性差異（P＜0.0 5）；環(huán)磷酰胺組同模型組比較，表達(dá)也減弱，差異具有顯著性（P＜0.05）；各組Bcl-2均有不同程度的表達(dá)，其中模型組Bcl-2高表達(dá)，各給藥組也有不同程度的表達(dá)，但較模型組表達(dá)有所減弱，高劑量組同模型組比較具有顯著性差異（P＜0.05）；環(huán)磷酰胺組同模型組比較，表達(dá)也減弱，差異有顯著性（P＜0.05），見表3—4。

表3 瑤寶克癌靈膠囊對(duì)S180荷瘤小鼠p53蛋白表達(dá)的影響

表4 瑤寶克癌靈膠囊對(duì)S180荷瘤小鼠Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

3 結(jié)論

IL-2具有促進(jìn)N K細(xì)胞增殖與活化，提高M(jìn) ф對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用等功能［2］；IFN-γ可抑制腫瘤細(xì)胞DNA合成，減緩細(xì)胞增殖各時(shí)相的進(jìn)展和細(xì)胞分裂速度［3］；p53基因是一種與細(xì)胞凋亡相關(guān)的抑癌基因，如果p53基因突變，就會(huì)喪失抑制細(xì)胞凋亡的作用，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的過度增殖［4］；Bcl-2屬原癌基因，是一種廣義的抗凋亡基因，可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖及增殖細(xì)胞的存活，導(dǎo)致各種腫瘤發(fā)生［5］。

研究結(jié)果表明瑤寶克癌靈膠囊可不同程度地提高IFN-γ、IL-2水平，抑制突變型基因p53和Bcl-2的表達(dá)。瑤寶克癌靈膠囊抗腫瘤的作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞因子水平，增強(qiáng)荷瘤小鼠免疫功能，抑制突變型基因p53和Bcl-2基因的表達(dá)有關(guān)，但其中更深層的機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。

［1］徐淑云，汴如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1994：1423.

［2］陳慰峰.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)［M］.3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：46-52.

［3］任偉，周國平.干擾素調(diào)節(jié)因子的抑制腫瘤作用［J］.生命的化學(xué)，2007（6）：541-544.

［4］Levi ne，A.J.Mom and，J.Fi nl ay，C.A.The p53 tum our suppressor gene［J］.N at ure，1991，351：453-456.

［5］田輝，高蔚.肺癌的細(xì)胞凋亡相關(guān)基因研究進(jìn)展［J］.肺癌雜志，1999，2（2）：129-130.

Investigation on Anti-tumor Mechanism of YaoBao KeAiLing Capsules

ZHAO Chengguo1，QIN Shuzhi1，MAO Jinglei2，WU Liyan1，XIAO Hongbin3△
1 Zhuhai College of Jilin University，Zhuhai 519041，China；2 Daqing Oilfield General Hospital；3 Heilongjiang University of Chinese Medicine

Objective：To explore anti-tumor mechanism of YaoBao KeAiLing capsules with molecular biology.Methods：The contents of interleukin-2（IL-2）and interferon-γ（IFN-γ）were detected with double antibody sandwich ELISA method；the expressions of Bcl-2 gene and p53 were measured by immunohistochemical method.Results：YaoBao KeAiLing capsules could increase the contents of IL-2 and IFN-γ in peripheral blood of mice，inhibit the expressions of p53 and Bcl-2.Conclusion：Anti-tumor mechanism of YaoBao KeAiLing capsules might be related to increasing the immunity of the mice，inhibiting the expressions of p53 and Bcl-2.

YaoBao KeAiLing capsules；IL-2；IFN-γ；p53；Bcl-2

R273.5

A

1004-6852（2014）05-0007-03

2013-10-10

趙成國（1978—），男，碩士研究生，講師。研究方向：中藥藥理學(xué)研究。

△通訊作者：肖洪彬（1957—），男，博士后合作導(dǎo)師，博士研究生導(dǎo)師，教授。研究方向：方劑配伍規(guī)律及方劑療效客觀化的研究。