南極海茸多糖結(jié)構(gòu)及其單糖組分的分析*

何晉浙，蔡如繁，孫培龍

(浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程系，浙江 杭州，310014)

南極海茸(Durvillaea antarctica)屬于淡黑巨海藻(Lessonia nigrescens)，是一種營養(yǎng)非常豐富的大型褐藻，主要分布在南極洲附近、智利南部的無污染巖石海域，因此它是一種純天然的優(yōu)質(zhì)極地海藻精華。近年來南極海茸逐漸地出現(xiàn)在人們的餐桌上。

海藻富含多種生命活性物質(zhì)如多糖、不飽和脂肪酸，牛磺酸、甾淳等，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力，抗病毒、促進(jìn)生長等作用。南極海茸作為海藻的一員，含有豐富的蛋白質(zhì)、纖維素、維生素、鈣、碘、鈉、鐵、鉀、磷、鋅、硒等礦物質(zhì)元素，高于很多陸地植物。無論是作為日常食物，還是作為藥品，海茸對人類都有著極大的益處［1－3］。目前，對于南極海茸的研究報道不是很多，對于海茸多糖的提取分離純化、光譜結(jié)構(gòu)分析、單糖組成等的研究更是鮮見。本文主要對海茸多糖進(jìn)行提取、分離純化，再對均一多糖進(jìn)行光譜掃描分析［4－5］，并采用氣相色譜法對均一多糖的單糖組成進(jìn)行了進(jìn)一步的分析［6］。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

南極海茸干品，威海壹品水產(chǎn)有限公司提供，原廠地南極。

DEAE-Sepharose Fast Flow，S-500 High-Resolution填料均購于美國CE公司;葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，單糖標(biāo)準(zhǔn)品:L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖、果糖、D-木糖、D-葡萄糖、L-山梨糖、L-鼠李糖和 L-巖藻糖，均為 Sigma公司產(chǎn)品。

苯酚、冰醋酸、醋酐、硼氫化鈉(NaBH4)、三氟乙酸(TFA)、三氯甲烷、甲醇、甲苯、無水硫酸鈉，均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與色譜條件

Waters 1525高效液相色譜儀(TSKgel G5000 PWXL色譜柱，Waters 2414示差檢測器，美國Water公司);UV－2450PC紫外分光光度計(Shimadzu日本島津公司);Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀(美國Thermo Nicolet公司);Agilent 7890A氣相色譜(DB－1701 毛細(xì)管柱(30 m ×320 μm ×0.25 μm)，F(xiàn)ID 檢測器，美國Aglient公司)。

高效液相色譜(HPLC)條件:流動相為超純水，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫(30 ±1)℃。

氣相色譜(GC)條件:高純氮做載氣，柱流速2 mL/min;程序升溫:柱初溫150℃，以5℃/min升溫至220℃，恒溫20 min。進(jìn)樣口溫度230℃，分流比1∶25;檢測器溫度255℃，氫氣流量30 mL/min，空氣流量350 mL/min，尾吹氣流量30 mL/min。

1.3 海茸多糖的提取與分離純化

1.3.1 多糖的提取

將南極海茸干品粉碎后過40目篩，加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，靜止12 h，過濾棄去上清液，反復(fù)脫脂3次，濾渣通風(fēng)處晾干，按料液比1∶33(g∶mL)加入蒸餾水，提取溫度86℃，提取時間31 min進(jìn)行微波提取多糖，離心取上清液，反復(fù)操作3次，合并提取液并濃縮到一定體積。用Sevag法［7］脫蛋白后，向所得的多糖提取液緩緩加入95%乙醇至體積分?jǐn)?shù)為30%，靜止12 h，離心后取沉淀物，加蒸餾水復(fù)溶后于水浴鍋上揮盡乙醇，再真空冷凍干燥得海茸粗多糖HRC30;余下的上清液按上述同樣方法得到HRC60和HRC80，備用。

1.3.2 多糖的分離純化

1.3.2.1 DEAE Sepharose Fast Flow離子柱層析

取海茸粗多糖HRC80組分溶于蒸餾水(30 mg/mL)，取10 mL過 DEAE-Sepharose Fast Flow離子柱(XK 26 cm ×100 cm)層析，分別以蒸餾水、0.1、0.2、0.4、0.8、2 mol/L的 NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，苯酚-硫酸法檢測［8］，根據(jù)顯色結(jié)果合并相同流分，濃縮凍干備用。

1.3.2.2 Sephacryl S-500凝膠層析

取離子柱層析得到的多糖樣品，用蒸餾水配成10 mg/mL。取1 mL過Sephacryl S-500凝膠柱，洗脫液為蒸餾水，苯酚-硫酸法檢測，收集多糖組分，濃縮凍干備用。

1.3.3 多糖純度及分子質(zhì)量測定

取標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖(分子質(zhì)量分別為2 000，1 400，670，270，150，80，50 kDa)配成 2% 的溶液，HPLC 檢測［9］。以保留時間為橫坐標(biāo)，lgMw(分子量)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程。

取純化得到的多糖樣品1 mg溶于1 mL蒸餾水，進(jìn)行HPLC分析，根據(jù)回歸方程計算多糖分子質(zhì)量大小和鑒定多糖的純度。

1.4 單糖的乙酰化

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)單糖的乙酰化

根據(jù)分子質(zhì)量精確稱取L-阿拉伯糖1.5 mg、D-半乳糖 1.8 mg、D-甘露糖 1.8 mg、果糖 1.8 mg、D-木糖 1.5 mg、D-葡萄糖 1.8 mg、L-山梨糖 1.8 mg、L-鼠李糖1.64 mg和L-巖藻糖1.64 mg，分別溶于5 mL蒸餾水中，配成2 mmol/L的溶液。加入20～30 mg NaBH4，于室溫下間歇振蕩，還原3 h。然后用冰醋酸中和過量的NaBH4，至不再產(chǎn)生氣泡為止，加入適量甲醇，40℃下減壓濃縮蒸干，重復(fù)4～5次，以完全除去反應(yīng)副產(chǎn)物硼酸和水分，然后置于真空干燥器中抽真空12 h。然后，在110℃烘箱中加熱15 min，除去殘留的水分。加入4 mL醋酐，密塞100℃反應(yīng)1 h，冷卻，然后加入3 mL甲苯，50℃左右減壓濃縮蒸干，重復(fù)4～5次，以除去多余的醋酐。最后，將乙酰化后的產(chǎn)物用3 mL三氯甲烷溶解，加入適量蒸餾水充分振蕩后，除去上層水溶液，如此重復(fù)4～5次。三氯甲烷層以適量的無水NaSO4干燥，定容至10 mL待GC分析［4，10］。

再分別精確量取乙酰化后的標(biāo)準(zhǔn)單糖溶液各1 mL混勻制成混標(biāo)后待GC分析。

1.4.2 海茸多糖的乙酰化

取2 mg海茸均一多糖樣品，放入25 mL梨形瓶中，加入2 mol/L的 TFA 4 mL，密塞后在110℃水解2～3 h。將水解液在低于40℃下減壓蒸干，然后加入3 mL甲醇旋干，重復(fù)4～5次，以完全除去TFA。然后按照1.4.1的方法進(jìn)行還原和乙酰化，最后用氯仿定容到5 mL，待 GC 分析［11］。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖的提純結(jié)果

2.1.1 海茸多糖的提取與分離

300 g南極海茸干品經(jīng)微波提取、除蛋白、乙醇沉淀后得到HRC30、HRC60、HRC80三個粗多糖組分，冷凍干燥后均為得到棕色粉末。得率分別為12.26%、4.22%、4.88%，采用苯酚-硫酸法測得其中總糖含量分別為32.94%、31.56%、35.19%。可見HRC30的得率最高，但HRC80的總糖含量最高。

HRC80經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow離子柱層析得到水相HRC-W和鹽相HRC-0.8;HRC-W經(jīng)Sephacryl S-500凝膠層析得到HRCS。

2.1.2 多糖HRCS的分子量及純度鑒定

將HRCS經(jīng)HPLC檢測，結(jié)果見圖1，單一對稱峰表明是均一多糖。

標(biāo)準(zhǔn)分子量的葡聚糖的HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，回歸方程為:y= －0.354 9x+10.512 4，R2=0.991 7。經(jīng)測定，HRCS的保留時間為14.816 min，根據(jù)回歸方程和多糖的保留時間，計算得出HRCS的平均分子量為1.79×105Da。

圖1 HRCS的HPLC曲線Fig.1 Curve of HRCS determination of HPLC

2.2 紫外光譜分析

圖2 葡聚糖系列在HPLC上分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of molecular weight determination of HPLC

稱取10 mg多糖樣品HRCS，配成3 mg/mL左右的樣品溶液，以蒸餾水做空白對照，在200～400 nm下進(jìn)行紫外全掃描，結(jié)果如圖3所示。該組分在280 nm和260 nm處幾乎沒有吸收峰，說明均不含有蛋白質(zhì)和核酸，而在200 nm處有一個較大的峰，是多糖的吸收峰。

圖3 HRCS的紫外全掃描光譜圖Fig.3 UV scanning of HRCS

2.3 紅外光譜分析

取2 mg多糖純品，115℃烘干1 h，然后再用KBr壓片后進(jìn)行常規(guī)的IR掃描，掃描范圍在4 000～400 cm－1。

HRCS的紅外光譜圖顯示(見圖4)，樣品在4 000～400 cm－1區(qū)域內(nèi)具有多糖物質(zhì)的一般性質(zhì)，其在3 400、2 900、1 600、1 000 cm－1左右均出現(xiàn)較強(qiáng)吸收峰。

在3 600 ～3 200 cm－1內(nèi)出現(xiàn)的3 401.8 cm－1吸收峰是糖分子中羥基(—OH)伸縮振動的結(jié)果;在3 000～2 800 cm－1內(nèi)出現(xiàn)的 2 924.3 cm－1吸收峰是C—H伸縮振動的結(jié)果;1 400～1 200 cm－1內(nèi)出現(xiàn)的1 340.3 cm－1附近的一些吸收峰是C—H的彎曲振動。這些吸收峰都是糖的特征吸收峰。1 730 cm－1左右沒有糖醛酸的吸收峰;1 653.8 cm－1處的峰是多糖水合振動峰，即羰基(—CHO)的C O伸縮振動。1 256.3 cm－1處的峰是酮糖類的C—C伸縮振動峰;1 200～1 010 cm－1范圍內(nèi)出現(xiàn)3個吸收峰為C—O伸縮振動峰，包括1 112.7 cm－1為吡喃糖環(huán)內(nèi)醚(C—O—C)的 C—O 伸縮振動，1 078.0 cm－1和1 045.1 cm－1為吡喃環(huán)中與羥基連接(C—O—H)的C—O伸縮振動，說明其中的單糖以吡喃糖苷的形式存在。另外，896.8 cm－1出現(xiàn)吸收峰為 β-構(gòu)型糖苷鍵的特征吸收峰，831.8 cm－1出現(xiàn)吸收峰為 α-構(gòu)型糖苷鍵的特征吸收峰，因此海茸多糖的單糖殘基以α-構(gòu)型和β-構(gòu)型的吡喃環(huán)的形式存在［12］。紅外光譜分析表見表1。

圖4 HRCS的紅外光譜圖Fig.4 FT-IR spectrum of HRCS

表1 HRCS的紅外光譜分析表Table 1 FT-IR analysis of HRCS

2.4 氣相色譜(GC)分析

根據(jù)9種單糖的單標(biāo)定性實驗，確定混標(biāo)的出峰順序依次是:L-鼠李糖、L-巖藻糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、果糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、L-山梨糖，見色譜圖5。其中5和6為果糖的2個色譜峰。各單糖的保留時間及其組分的面積百分含量如表2所示，根據(jù)平均面積百分含量，計算出各個單糖組分相對于儀器的響應(yīng)因子，以利于之后樣品組分摩爾比計算。

海茸多糖HRCS水解衍生化后，得到的氣相色譜圖如圖6所示，可以看出HRCS中含有3種單糖，對照混合標(biāo)準(zhǔn)單糖的色譜圖，單糖組分的面積百分含量見表3。

圖5 混合標(biāo)準(zhǔn)單糖的氣相色譜圖Fig.5 Gas chromatogram of complex standard monosaccharides

表2 混合標(biāo)準(zhǔn)單糖氣相色譜結(jié)果及分析Table 2 Results and analysis of the standard monosaccharides

圖6 HRCS的氣相色譜圖Fig.6 Gas chromatogram of monosaccharides in HRCS

表3 HRCS氣相色譜結(jié)果及分析Table 3 Results and analysis of the monosaccharides in HRCS

3 結(jié)論

南極海茸干品經(jīng)微波提取、分級醇沉后得到海茸粗多糖 HRC30、HRC60及 HRC80，得率分別為12.26%、4.22%、4.88%。HRC80經(jīng)過陰離子交換柱層析和凝膠層析處理后分離得到均一多糖HRCS。結(jié)合HPLC、紫外全掃描、紅外光譜掃描和GC分析，結(jié)果可討論如下:

第1，HRCS的分子質(zhì)量為1.79×105Da，不含蛋白質(zhì)和核酸，分子質(zhì)量對于多糖的活性有一定的影響，中等分子質(zhì)量多糖的活性大于高分子量及低分子質(zhì)量的多糖，因為相對分子量越大，越不利于多糖穿越多重細(xì)胞膜障礙而進(jìn)入生物體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)活性，但分子量過低也無法形成產(chǎn)生活性的聚合結(jié)構(gòu)，另外不同的多糖產(chǎn)生生物學(xué)活性的最佳相對分子質(zhì)量的范圍不同，據(jù)報道，一般海藻多糖分子量在1×105～5×105Da之間具有顯著活性，因此海茸多糖HRCS的生物學(xué)活性較顯著［13］。

第2，單糖殘基以α-構(gòu)型和β-構(gòu)型的吡喃環(huán)的形式存在，而β-構(gòu)型的糖苷鍵對于抑制腫瘤、增強(qiáng)免疫、促進(jìn)生長等的作用顯著，具有生物學(xué)活性。

第3，HRCS 由 L-巖藻糖、D-半乳糖和 D-葡萄糖組成，摩爾比為2.18∶0.82∶1，而巖藻糖具有多種生物活性，如抑制腫瘤、調(diào)節(jié)免疫以及抑制血栓形成等。

［1］ 陳彥，謝繼鋒，金先菊，等.海藻多糖的分離純化和組成分析［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，31(5):710－717.

［2］ 劉斌，王長云，張洪榮，等.海藻多糖褐藻膠生物活性及其應(yīng)用研究新進(jìn)展［J］.中國海洋藥物，2004，23(6):36－41.

［3］ 謝苗，鐘劍霞，甘純璣.海藻多糖的藥用功能與展望［J］. 中國藥學(xué)雜志，2001，36(8):513 －516.

［4］ 張安強(qiáng).猴頭菌子實體多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定、結(jié)構(gòu)修飾和生物活性研究［D］.南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006:40－49.

［5］ 葉林.螺螄多糖的提取，分離，結(jié)構(gòu)和活性研究［D］.杭州:浙江工商大學(xué)，2010:42－73.

［6］ 何晉浙，胡飛華，孫培龍，等.枸杞多糖結(jié)構(gòu)及其單糖組分的分析研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34(5):48－54.

［7］ 齊慧玲，魏紹云，王繼倫，等.Sevag法去除白及多糖中蛋白的研究［J］.天津化工，2000(3):20－21.

［8］ 葛青，張安強(qiáng)，孫培龍.桑黃子實體多糖的分離純化及單糖組成研究［J］.食品科學(xué)，2008，29(9):291－294.

［9］ 劉長福，劉濤，劉秀梅.高效液相色譜法測定香菇多糖的分子量［J］.化學(xué)工程師，2005，118(7):28－29.

［10］ 王宗君.茶樹菇多糖提取與抗氧化性研究［D］.南寧:廣西大學(xué)，2007，16 －29.

［11］ 葉林，張虹.質(zhì)譜及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在多糖結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用［J］.理化檢驗:化學(xué)分冊，2010，(11):1355－1359.

［12］ 孫延芳，李子昂，梁宗鎖，等.食用菌多糖及其紅外光譜分析［J］. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，10(38).

［13］ 王兆梅，李琳，郭祀遠(yuǎn)，等.活性多糖構(gòu)效關(guān)系研究評述［J］.現(xiàn)代化工，2002，22(8):18－21.