黑蒜中呈色物質(zhì)5-羥甲基糠醛的分離鑒定及其生成動(dòng)力學(xué)*

卜利偉，邱瑞霞，黃雪松

(暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州，510632)

黑蒜(black garlic)是在控制環(huán)境中溫度和濕度的情況下，新鮮大蒜(Allium sativum L.)自然發(fā)酵而成的產(chǎn)品［1］。在黑蒜加工過(guò)程中，新鮮大蒜先在低溫條件下熟化一定時(shí)間后，再高溫熟化成最終產(chǎn)品，其中低溫熟化階段主要發(fā)生酶促反應(yīng)，而高溫熟化階段主要發(fā)生非酶褐變反應(yīng)，包括Maillard反應(yīng)、焦糖化反應(yīng)、Vc氧化分解等［2］。這些反應(yīng)產(chǎn)生的一些褐變產(chǎn)物使黑蒜擁有了相對(duì)于新鮮大蒜更加豐富的功能成分和更強(qiáng)的生物活性［3］。而這些反應(yīng)所產(chǎn)生的一些呈色物質(zhì)使得新鮮大蒜的顏色從自然白色漸變?yōu)辄S色、咖啡色到最終的黑色［4］。

成熟的黑蒜兼具黑色和強(qiáng)生物活性，可見(jiàn)黑蒜的呈色物質(zhì)與品質(zhì)之間應(yīng)當(dāng)存在一定關(guān)系，此外，呈色物質(zhì)本身也有一些生物活性，如類(lèi)黑精的抗氧化特性［5］，5-HMF可治療內(nèi)毒素血癥及降低因此誘發(fā)的多臟器功能衰竭所致死亡等方面的作用［6］。郭彩華［7］等證實(shí)黑醬油中類(lèi)黑素粗制品對(duì)DPPH自由基的清除率最高達(dá)89.0%，對(duì)羥自由基的清除能力達(dá)89.5%，而類(lèi)黑素正是黑醬油呈色的主要物質(zhì)。因此，如果了解了黑蒜生產(chǎn)中某種呈現(xiàn)黑色物質(zhì)的生成規(guī)律，便可以利用呈色物質(zhì)和黑蒜品質(zhì)之間的函數(shù)關(guān)系在黑蒜加工的過(guò)程中對(duì)黑蒜的品質(zhì)進(jìn)行監(jiān)控。為此，本文將對(duì)黑蒜中主要呈色物質(zhì)進(jìn)行分離鑒定，并通過(guò)不同溫度等處理研究其生成規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

新鮮大蒜，產(chǎn)自山東省金鄉(xiāng)縣，購(gòu)自廣州市天河區(qū)石牌蔬菜市場(chǎng);購(gòu)自Dikma公司的色譜純甲醇;無(wú)水乙醇(分析純)，購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠(chǎng);5-HMF(98.0%)購(gòu)自 Sigma公司;所有用水均為Mili-Q純化系統(tǒng)純化水。

1.2 儀器與設(shè)備

FHS-2A可調(diào)高速勻漿機(jī)，金壇市宏華儀器廠(chǎng);DHG-9070A烘箱，上海一恒科技有限公司;Prominence LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司;4000 Qtrap四極桿-線(xiàn)性阱復(fù)合型質(zhì)譜儀，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.3 樣品前處理

第一階段:凍結(jié)，將樣品(3 kg新鮮大蒜分裝到100個(gè)小袋，每袋30 g)放入－70℃冰箱冷凍48 h。

第二階段:低溫熟化，從－70℃冰箱中取出樣品放入45℃恒溫烘箱里，熟化72 h，期間每隔8 h取出2袋樣品，測(cè)定物料中的5-HMF含量。

第三階段:高溫熟化，從低溫熟化后的樣品中取72袋樣品平均放進(jìn)3個(gè)恒溫烘箱中，溫度分別設(shè)定為70，80和90℃，熟化72 h，期間每個(gè)烘箱每隔8 h取出2袋樣品，測(cè)定物料中的5-HMF含量(2袋樣品的平均值)。

1.4 黑蒜呈色物質(zhì)的分離鑒定

將150 g活化后的硅膠裝入燒結(jié)漏斗中(內(nèi)徑10 cm，長(zhǎng)15 cm)。取一定量的黑蒜樣品經(jīng)破碎、離心后，用乙酸乙酯萃取3次，萃取液旋蒸濃縮至一定體積，然后濃縮液與15 g活化后的硅膠合并在一起濃縮干燥得到硅膠和樣品的混合物。將其均勻鋪在150 g硅膠表面，以100 mL的石油醚-乙酸乙酯(體積比=1∶1)為初始洗脫液，不斷增加初始洗脫液中的甲醇比例來(lái)提高極性進(jìn)行減壓洗脫，每100 mL收集一瓶，共收集21瓶洗脫液。

1.5 黑蒜呈色物質(zhì)的ESI-MS鑒定

將真空柱分離后的第4瓶洗脫液中黑色物質(zhì)進(jìn)行ESI-MS鑒定，質(zhì)譜條件為離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，電離方式EI;電子能量70 eV，溶劑延遲時(shí)間為2 min，采用正離子模式，掃描質(zhì)量范圍20～500 m/z，采集方式為掃描，質(zhì)量分析數(shù)據(jù)庫(kù)為Nist 9811。

1.6 加5-HMF內(nèi)標(biāo)鑒定黑蒜中的呈色物質(zhì)

將真空柱分離后的第4瓶洗脫液分成2份(1份加入一定濃度的5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品，1份不加)，然后用HPLC進(jìn)行分析。色譜條件為Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)284 nm，柱溫40℃，流動(dòng)相為甲醇∶水(體積比 =10∶90)，流速0.8 ml/min，進(jìn)樣量為 10 μL［8］。

1.7 5-HMF含量測(cè)定

1.7.1 5-HMF標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)量0.14 g 5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品定容至100 mL，依次稀釋為 2.8、11.2、22.4、44.8、89.6、179.2、358.4 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.6部分所述色譜條件下進(jìn)樣。以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)做線(xiàn)性回歸方程y=82 114x－9 699.6，R2=0.998 9(n=7)，檢測(cè)方法在2.8～358.4 mg/L線(xiàn)性良好。

1.7.2 5-HMF含量測(cè)定

將1.3部分不同溫度不同加工時(shí)間取出的物料切碎、勻漿、離心后加入體積分?jǐn)?shù)80%乙醇，靜置12 h后離心去沉淀，然后加入80%乙醇定容至100 mL，靜置2 h，吸取一定量上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后打入進(jìn)樣小瓶中用1.6部分所述色譜條件進(jìn)行HPLC測(cè)定，同時(shí)以5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品為外標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑蒜呈色物質(zhì)的分離鑒定

根據(jù)1.4部分方法洗脫得到了21瓶洗脫液，其中第3瓶洗脫液呈現(xiàn)微黃色，第4瓶［其洗脫液是石V(油醚)∶V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)=31∶31∶38］洗脫液揮發(fā)完后剩下的物質(zhì)呈現(xiàn)較重的黑色，將其用一定量乙酸乙酯重溶后做ESI-MS鑒定，圖1顯示有3個(gè)明顯的離子峰，其質(zhì)荷比分別是127、144、149，推測(cè)它們分別是 5-HMF(其 M=126)的 M+H+、M+Na+、M+NH4+峰，即圖1所代表的樣品應(yīng)當(dāng)為5-HMF的MS圖。

圖1 黑蒜呈色物質(zhì)的質(zhì)譜鑒定Fig.1 The mass spectrum identification of the color material of black garlic

為進(jìn)一步確定該洗脫液中的呈色物質(zhì)為5-HMF，采用1.6部分所述加標(biāo)方法進(jìn)行鑒定。圖2結(jié)果表明，瓶號(hào)4樣品在加入5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品之前，“M”的峰強(qiáng)度約為400 mAU，而加入5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品后，其保留時(shí)間與未加5-HMF時(shí)相同，且“M+HMF”峰的峰強(qiáng)度約為1150 mAU。綜合考慮該結(jié)果與圖1的MS結(jié)果，可以得出一個(gè)結(jié)論:即該洗脫液中呈色物質(zhì)成分應(yīng)為5-HMF。黑蒜成熟與否可以通過(guò)5-HMF含量來(lái)體現(xiàn)，因此，用HPLC測(cè)定.3個(gè)溫度條件下不同加工時(shí)期5-HMF的生成含量。

圖2 加5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品之前和之后對(duì)比Fig.2 The comparison of results before and after adding 5-HMF

2.2 黑蒜加工過(guò)程中5-HMF的生成規(guī)律

2.2.1 5-HMF檢測(cè)方法的確定

圖3－a是5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜，通過(guò)配制2.8～358.4 mg/L濃度的5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品，用Excel作圖得到線(xiàn)性回歸方程y=82 114x－9 699.6。圖3－b是黑蒜提取物的 HPLC圖譜。由圖3－b可見(jiàn)，5-HMF在13.87 min出峰，且峰形對(duì)稱(chēng)無(wú)干擾，可以滿(mǎn)足測(cè)定黑蒜中5-HMF的要求。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中5-HMF的測(cè)定圖譜Fig.3 HPLC chromatogram of 5-HMF standard and the sample

將圖3－b中對(duì)應(yīng)5-HMF保留時(shí)間的峰面積帶入上述回歸方程中計(jì)算出5-HMF的含量，由圖4可知，(1)70、80、90℃ 3個(gè)溫度下加工成的黑蒜產(chǎn)品的5-HMF 含量分別為 4.79、31.28、154.87 μg/g，證明較高溫度會(huì)促進(jìn)5-HMF生成。5-HMF是Maillard反應(yīng)重要的中間產(chǎn)物，其不僅是Maillard反應(yīng)和非酶褐變的重要指示因子，也是色素沉積的潛在條件［9］。在黑蒜熟化過(guò)程的“低溫熟化”階段，物料無(wú)5-HMF產(chǎn)生，表明新鮮大蒜本身無(wú)5-HMF，并且在45℃低溫熟化72 h也沒(méi)有5-HMF產(chǎn)生，此階段的生化反應(yīng)主要是以大蒜中的水解酶類(lèi)(如大蒜果聚糖水解酶［10］)為主的酶促反應(yīng)，此階段的物料顏色由最初的白色逐漸呈現(xiàn)出微黃色。(2)在“高溫熟化”階段的反應(yīng)主要為非酶褐變反應(yīng)，5-HMF開(kāi)始積累，同時(shí)物料的顏色開(kāi)始由黃色迅速變成咖啡色，然后變成最終的黑色，此時(shí)得到了成熟黑蒜產(chǎn)品，并顯示出黑蒜的各種生理活性和功能特性。(3)3種溫度下的5-HMF含量均呈指數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì)，用origin8.0軟件進(jìn)一步對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到時(shí)間與5-HMF含量的函數(shù)關(guān)系見(jiàn)表1(P ＜0.05)。

圖4 5-HMF隨著溫度和時(shí)間的含量變化Fig.4 The variation in content of 5-HMF as the temperature and time

2.2.2 5-HMF生成反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

將加工時(shí)間和5-HMF的函數(shù)關(guān)系用零級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型和一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行擬合分析發(fā)現(xiàn)，其函數(shù)關(guān)系更符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程(表2)。而且C0=1.02 μg/g，速率常數(shù)的對(duì)數(shù)和溫度的關(guān)系符合方程ln K=－3 862.5(1/T)+7.98，其積分式為K=e7.98exp(－3 862.5/T)= 2.91×103 exp(－32.11/RT)，此方程符合阿雷尼烏斯公式。其中頻率因子Kf=2.91×103h－1，反應(yīng)活化能Ea=32.11 kJ/mol。

表1 5-HMF生成的動(dòng)力學(xué)方程Fig.1 Kinetics of the 5-HMF formation reaction in black garlic

圖5 5-HMF生成的阿雷尼烏斯曲線(xiàn)Fig.5 Arrhenius plots for 5-HMF accumulation

陳磊［11］證實(shí)黃酒中5-HMF的生成反應(yīng)也屬于一級(jí)反應(yīng)，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。此外，F(xiàn)allico［12］研究蜂蜜當(dāng)中5-HMF的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同種類(lèi)蜂蜜中5-HMF的反應(yīng)活化能在32.5～43.6 kJ/mol之間，而本實(shí)驗(yàn)測(cè)得5-HMF的反應(yīng)活化能為32.11 kJ/mol，由此可見(jiàn)，在不同的反應(yīng)體系中，同一種物質(zhì)的反應(yīng)活化能會(huì)有所不同，陳磊在研究黃酒中5-HMF的生成動(dòng)力學(xué)時(shí)證實(shí)弱極性物質(zhì)會(huì)促進(jìn)5-HMF生成。

3 討論

一般認(rèn)為，低分子有色化合物和高分子的類(lèi)黑精是發(fā)酵食品顯黑色的主要原因，5-HMF屬于低分子黑色化合物的一種，在真空硅膠柱純化收集到的21瓶洗脫液中，除第4瓶洗脫液(主要物質(zhì)是5-HMF)之外，第20瓶洗脫液，即石油醚-乙酸乙酯-甲醇(體積比=31∶31∶38)洗脫液部分也呈黑色。第20瓶洗脫液的極性大于第4瓶洗脫液極性，因此推測(cè)此部分洗脫液有可能是大分子的類(lèi)黑精。然而由于類(lèi)黑精成分復(fù)雜，無(wú)法對(duì)其定性定量分析，而5-HMF是一種已知的物質(zhì)，而且5-HMF的檢測(cè)方法已經(jīng)建立，研究其生成規(guī)律相對(duì)容易，因此，5-HMF用來(lái)監(jiān)控黑蒜的品質(zhì)更準(zhǔn)確和方便。此外，本實(shí)驗(yàn)以溫度為變量，pH等其他因素對(duì)黑蒜中5-HMF生成規(guī)律的影響有待進(jìn)一步研究，不過(guò)Fallico等人以溫度和pH為變量證實(shí)5-HMF生成屬于偽一級(jí)反應(yīng)，即當(dāng)pH固定時(shí)，單一以溫度為變量，5-HMF的生成屬于一級(jí)反應(yīng)。

目前關(guān)于5-HMF好壞的報(bào)道仍有較大的爭(zhēng)議［13－14］，因此，通過(guò)應(yīng)用黑蒜加工過(guò)程中 5-HMF 含量和加工時(shí)間的動(dòng)力學(xué)模型中的參數(shù)可以控制5-HMF的生成含量。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)分離鑒定出黑蒜中的主要呈色物質(zhì)之一5-HMF，并通過(guò)不同溫度條件下的加工，測(cè)定不同時(shí)期物料的5-HMF含量，發(fā)現(xiàn)加工時(shí)間和5-HMF含量的函數(shù)關(guān)系符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程，應(yīng)用于阿雷尼烏斯方程后得到其活化能為32.11 kJ/mol。利用這個(gè)動(dòng)力學(xué)模型可以有效控制5-HMF的生成量。例如在黑蒜加工過(guò)程中，可以通過(guò)低溫延長(zhǎng)熟化時(shí)間來(lái)減少5-HMF含量生成，此外，也可以利用該動(dòng)力學(xué)模型可以對(duì)黑蒜成熟與否和黑蒜品質(zhì)做出評(píng)判。

［1］ 安東.食品加工工藝的研究［D］.山東:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

［2］ Beveridge T，F(xiàn)ranze K，Harrison J.Clarified natural apple juice:production and storage stability of juice and concentrate［J］.Journal of Food Science，1986，51(2):411 －414.

［3］ 雷逢超，郝果，朱黎，等.黑蒜的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及保健作用的研究進(jìn)展［J］.食品工業(yè)科技，2012，33(13):429－432.

［4］ 龔平，闞建全.美拉德反應(yīng)產(chǎn)物性質(zhì)的研究進(jìn)展［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35(4):141－146.

［5］ 秦禮康，霄霖.陳窖豆豉粑類(lèi)黑精組分體外抗氧化活性研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32(1):88－92.

［6］ 普文英.5-羥甲基糠醛的藥物用途［P］.中國(guó)，CN1704050.2005－12－07.

［7］ 郭彩華，林麗，陳韶華，等.黑醬油類(lèi)黑素的提取、光譜性質(zhì)及功能［J］.食品科學(xué)，2012，33(11):89－93.

［8］ 陳磊，黃雪松.高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)黃酒中的5-羥甲基糠醛和9種多酚［J］.分析化學(xué)，2010，38(1):133－137.

［9］ Garza S，Ibarz A，Pagan J，et al.Non-enzymatic browning in peach puree during heating［J］.Food research international，1999，32(5):335 －343.

［10］ CHEN Lei，HUANG Huahong，LIU Wenbao，et al.Kinetics of the 5-Hydroxymethylfurfural Formation Reaction in Chinese Rice Wine［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry.2010，58(6):3 507－3 511.

［11］ Cheong K，Yan Fengchao，Huang Xuesong，et al.Enymologic characterization of garlic fructan exohydrolase［J］.Journal of Food Biochemistry.2012，36(2):248 －253.

［12］ Fallico B，Zappala M，Arena E，et al.Effects of conditioning on HMF content in unifloral honeys［J］，F(xiàn)ood Chemistry，2004，85(2):305－313.

［13］ 趙玲，張?zhí)m，李雅莉，等.5-羥甲基糠醛對(duì)腦缺血再灌注模型小鼠學(xué)習(xí)記憶及腦部自由基的影響［J］.中國(guó)藥房，2007，18(13):974－976.

［14］ Durling L，Busk L，Hellman B.Evaluation of the DNA damaging effect of the heat-induced food toxicant 5-hydroxymethylfurfural(HMF)in various cell lines with different activities of sulfotransferases［J］.Food and Chemical Toxicology，2009，47(4):880－884.