基于酸性電解水處理的金槍魚殺菌技術(shù)研究

高 萌，張 賓，*，勵建榮，柳佳娜，蘇意誠

（1.浙江海洋學院，食品與醫(yī)藥學院，浙江舟山316000；2.渤海大學，化學化工與食品安全學院，遼寧錦州121013；3.俄勒岡州立大學，海洋食品研究與教育中心，美國俄勒岡州97403）

金槍魚肉富含蛋白質(zhì)、維生素A、D和微量元素，尤其二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA）等n-3多不飽和脂肪酸、蛋氨酸和牛磺酸等含量豐富，是國際營養(yǎng)學會重點推薦的健康食品[1]。對于金槍魚加工利用，一般將其冷凍后制成凍金槍魚肉，進而用來制成生魚片、壽司、調(diào)味及罐裝食品。金槍魚生魚片既保持了大部分營養(yǎng)物質(zhì)又具有鮮美的滋味，因而備受廣大消費者青睞。作為高品質(zhì)生魚片進行食用，必須具備微生物含量低、肌肉色澤鮮艷及解凍血水汁液滲出少等條件[2]。新鮮金槍魚肉帶菌量較少，如在加工過程中采取無菌操作而制備出的生魚片，可滿足人們生食的衛(wèi)生要求。但實際在生魚片貯運及加工過程中，遭受二次污染的機會很多，根本無法做到無菌操作，因此生魚片在未經(jīng)進一步加工滅菌情況下被直接食用，極有可能因魚肉中的微生物超標而引發(fā)食物中毒等多種食源性疾病[3]。

消費者在食用生魚片時，通常以綠芥末和醬油作為殺菌佐料，認為通過醮食方式即可起到有效殺滅微生物效果。而隨著因食用生魚片而引發(fā)的食源性疾病問題的頻發(fā)，使得越來越多消費者對于芥末、醬油等殺菌佐料的實際效果產(chǎn)生了疑問[4]。崔竹梅等[5]對草魚魚片的菌落總數(shù)和菌相進行了研究，并探討了生姜、醬油、醋等對于生魚片的殺菌效果，但其并未提出具體殺菌調(diào)味劑配方。郭姍姍等[6]采用臭氧水和二氧化氯處理脆肉鯇魚片，取得了良好減菌化效果，但此種強氧化劑殺菌處理方式對于魚片品質(zhì)影響較大。龔婷等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在鮮草魚片加工過程中，切片及后續(xù)浸泡工序是減少其遭受二次污染的關(guān)鍵控制點。

酸性電解水作為一種新興殺菌溶液，首先由日本研發(fā)成功，并被指定為一種安全的食品殺菌劑，用于殺滅金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及沙門氏菌等，效果十分顯著[8]。張向陽等[9]采用pH2.35酸性電解水清洗鮮切胡蘿卜，在低耗水條件下即可對鮮切胡蘿卜達到顯著抑菌效果。藍蔚青等[10]的研究發(fā)現(xiàn)pH2.62、ACC為41.5mg/L的酸性電解水能在短時間內(nèi)抑制帶魚中微生物的生長繁殖，同時明顯減緩TVBN含量的升高，可使帶魚冷藏貨架期延長2～3d。目前，國內(nèi)外關(guān)于電解水的殺菌應(yīng)用研究，絕大多數(shù)均集中在酸性較低（pH＜2.7）的電解水方面，而較低pH對于食品品質(zhì)（尤其水產(chǎn)品）、包裝運輸材料腐蝕性大，且由于強酸性電解水制造成本高、受外界有機物影響較大、溶液中有效氯極不穩(wěn)定等原因，極大地限制了其應(yīng)用范圍[11-12]。關(guān)于酸性電解水在冷凍金槍魚及其生魚片制品中保鮮、殺菌應(yīng)用研究還未見報道。本文針對冷凍金槍魚（鰹魚，Skipjack tuna）魚片在凍藏、加工及食用過程中微生物易污染問題，通過酸性電解水鍍冰衣技術(shù)、不同殺菌劑的殺菌效果及配方優(yōu)化研究，旨在探討冷凍金槍魚貯藏品質(zhì)保證的新方法，以及確定一種對于生魚片既能殺菌又符合口味要求的殺菌劑基礎(chǔ)配方。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金槍魚（鰹魚，Skipjack tuna） 浙江興業(yè)集團有限公司；食醋（總酸4.50～4.99g/100mL）、加飯酒（酒精度15.0%，V/V）、芥末醬（主要成分為西洋山葵和鮮山葵） 均為市售；結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（MUG）等 青島拓普生物工程有限公司；大腸埃希氏菌（ATCC 25922，Escherichia coli） 廣州市微生物研究所；實驗所用試劑 均為國產(chǎn)分析純。

FX-SASAL型電解水生成器 煙臺方心水處理設(shè)備有限公司；HS-1300型潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HWS-270型智能恒溫恒濕箱 常州越科有限公司；DF-U53V型超低溫冰箱 日本SANYO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 金槍魚預(yù)處理 冷凍金槍魚（鰹魚）貯藏于-55℃超低溫冰箱中，使用前采用溫鹽水法解凍。將魚肉浸置于NaCl濃度3.0%、溫度40℃的鹽水中90s后取出，濕紗布包裹，放置于4℃冰箱中，靜置解凍12h，使魚肉內(nèi)部與表面溫度均一。解凍后魚肉進行整理、切分，備用。

1.2.2 酸性電解水制備 濃度為0.15%NaCl溶液，在電解水生成器中進行電解，電解條件為：電流0.2A、電壓6.3V、時間5min，獲得酸性電解水（Acidic Electrolyzed Water，AEW）。經(jīng)測定該電解水pH為4.5、氧化還原電位為836.5mV、有效氯含量為31.7mg/L。實驗所用酸性電解水，制備后立即使用。

1.2.3 AEW鍍冰衣對于冷凍金槍魚的抑菌效果 首先將解凍金槍魚魚肉塊（10cm×5cm×5cm）置于含103cfu/mL大腸埃希氏菌溶液中1～2s（染菌），取出瀝干并于室溫下放置3h（增菌），然后置于-55℃超低溫冰箱中冷凍4h，取出立即浸沒于pH為4.5 AEW中3～5s（4℃），鍍冰衣后魚塊裝入塑料封口袋中，貯藏于-18℃冰箱中。每隔10d，測定樣品中細菌總數(shù)和大腸埃希氏菌數(shù)量。

實驗分組：蒸餾水鍍冰衣（空白組）和酸性電解水鍍冰衣（AEW組）。

1.2.4 殺菌劑對于解凍金槍魚的殺菌效果及配方優(yōu)化 選用殺菌劑種類為食醋、芥末醬、加飯酒、AEW及（煮沸后）醬油。前期研究發(fā)現(xiàn)，所用食醋、芥末醬、加飯酒、AEW及（煮沸后）醬油樣品自身中，菌落總數(shù)均低于8cfu/g，大腸埃希氏菌均未檢出（注：未煮沸醬油本身細菌總數(shù)含量較高，因此采用煮沸殺菌處理）。實驗發(fā)現(xiàn)，煮沸后的醬油無殺菌活性，因此以食醋、芥末、加飯酒及AEW為影響生魚片殺菌效果的主要影響因素，進行如表1所示的4因素3水平正交實驗。具體操作：在符合衛(wèi)生要求的廚房中，將解凍后金槍魚制備成生魚片（6cm×5cm×0.5cm），然后將生魚片浸沒于103cfu/g大腸埃希氏菌溶液中1～2s（染菌），取出瀝干并置于空氣中3h（增菌），再浸沒于不同殺菌劑中8～10s，取出后立即測定生魚片中菌落總數(shù)、大腸埃希氏菌的數(shù)量，優(yōu)化獲得生魚片最佳殺菌劑組合。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Experimental factors and levels of orthogonal experiment

1.2.5 微生物測定方法 細菌總數(shù)測定參照GB 4789.2-2010進行；大腸埃希氏菌測定參照GB 4789.38-2012進行。

1.3 數(shù)據(jù)分析

對于金槍魚鍍冰衣處理、樣品細菌總數(shù)及大腸埃希氏菌的測定，均至少完成3個平行，數(shù)據(jù)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件，結(jié)果為平均值±標準偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 AEW鍍冰衣對于冷凍金槍魚的抑菌效果

金槍魚鍍冰衣的后處理技術(shù)是為了防止魚體低溫貯藏及運輸過程中，肌肉表面出現(xiàn)干燥、油脂外溢等干耗甚至油燒現(xiàn)象。傳統(tǒng)自來水冰衣雖可防止魚體脂類和色素的氧化，但其附著力較弱、易脫落，因此無法有效防止魚體遭受腐敗及致病微生物的侵染與繁殖。蒸餾水、AEW冰衣對于冷凍金槍魚在凍藏（-18℃）過程中抑菌效果，如表2所示。蒸餾水鍍冰衣組：0～40d凍藏期內(nèi)，魚體中細菌總數(shù)、大腸埃希氏菌數(shù)量無顯著性變化，可能是由于低溫貯藏暫時鈍化了微生物生長與繁殖；隨著貯藏時間延長（80～320d），細菌總數(shù)、大腸埃希氏菌顯著性增加（p＜0.05），其原因可能是部分耐低溫菌適應(yīng)了低溫環(huán)境，且在解凍過程中恢復(fù)了一定繁殖能力，致使細菌總數(shù)、大腸埃希氏菌顯著性增加[13]。AEW鍍冰衣組：0～160d凍藏期內(nèi)，魚體中細菌總數(shù)、大腸埃希氏菌始終保持在較低范圍內(nèi)，且呈現(xiàn)出顯著降低趨勢（p＜0.05）；凍藏至320d時，魚體中細菌總數(shù)、大腸埃希氏菌有所回升，但仍顯著低于蒸餾水鍍冰衣魚肉。

表2 AEW鍍冰衣對于冷凍金槍魚的抑菌效果（-18℃）Table 2 Antibacterial effect of AEW coating ice on the frozen tuna（-18℃）

由此可見，AEW鍍冰衣對于冷凍金槍魚在整個貯藏期內(nèi)（0～320d）均具有顯著的抑菌效果，尤其在（0～160d）內(nèi)，可顯著降低魚肉中的微生物含量。研究發(fā)現(xiàn)，酸性電解水在溶液狀態(tài)時，由于外界光照、氧氣及加熱等作用下，易出現(xiàn)分解進而轉(zhuǎn)變成為普通水，因此如果直接應(yīng)用，其實際殺菌作用時間相對較短[14]。此外，AEW碎冰同樣能表現(xiàn)出良好的抑菌活性，如對大腸桿菌、摩氏摩根菌等殺滅效果顯著，同時還可有效防止紅肉魚中組胺的形成與蓄積[15]。本研究中將AEW制成冷凍金槍魚的外包冰衣，在金槍魚貯藏過程中通過AEW冰中緩慢釋放的ClO-、ClO2-、O3、H2O2及[O]等活性物質(zhì)，可有效抑制細菌的細胞質(zhì)酶活性，并損壞細菌外層細胞膜進而導(dǎo)致細菌的死亡[16-17]，有效延長了酸性電解水有效抑菌作用時間，因此對金槍魚在較長冷凍貯藏期內(nèi)均能表現(xiàn)出良好抑菌活性。

2.2 金槍魚生魚片殺菌劑的配方優(yōu)化

2.2.1 不同殺菌劑的殺菌效果比較 食醋、芥末、加飯酒、（煮沸后）醬油及AEW對于金槍魚生魚片中細菌總數(shù)、大腸埃希氏菌殺菌效果，如表3所示。結(jié)果表明，相對于空白處理（蒸餾水），食醋、芥末及AEW均表現(xiàn)出顯著的殺菌活性，而煮沸后的醬油基本無殺抑菌活性（p＞0.05）。因此，選定食醋、芥末、加飯酒及AEW為基礎(chǔ)殺菌劑，進行下一步的單因素及正交優(yōu)化實驗。

表3 不同菌劑對生魚片的殺菌效果Table 3 Antibacterial effect of different condiments on the tuna sashimi

2.2.2 單因素實驗結(jié)果 染菌后魚肉于室溫下放置3h后（增菌），浸沒于不同殺菌劑中8～10s，取出后立即測定生魚片中菌落總數(shù)，結(jié)果如圖1所示。隨著食醋添加體積不斷增大，其對生魚片的殺菌效果不斷增強；當食醋體積增加至8mL及以上時，殺菌效果改善作用不顯著（p＞0.05）。對于芥末的殺菌效果，隨著芥末添加量增加，其殺菌效果不斷增強；但考慮到生魚片在食用過程中，芥末會產(chǎn)生強烈刺激性感覺，因此在殺菌配方優(yōu)化過程中以較低添加量（1～6mL）為主要研究范圍。加飯酒的殺菌活性相對較弱，但其仍能顯著降低生魚片中細菌總數(shù)含量。對于AEW的殺菌效果，當生魚片中添加量超多4mL后，其殺菌效果無顯著性改變（p＞0.05）。

2.2.3 正交實驗結(jié)果 在綜合考慮不同殺菌劑對于生魚片感官品質(zhì)影響的基礎(chǔ)上，分別以對細菌總數(shù)、大腸埃希氏菌的殺滅效果為評價指標，獲得了金槍魚生魚片最佳殺菌劑組合及因素主次順序（表4）。對生魚片中細菌總數(shù)殺滅效果：食醋＞芥末＞AEW＞加飯酒，即當食醋8.0mL、芥末1.0mL、AEW 2.0mL、加飯酒1.0mL時，制備復(fù)合殺菌劑殺菌效果最佳（A2B3C1D1）。經(jīng)驗證實驗（3個平行）發(fā)現(xiàn)，此組合處理生魚片菌落總數(shù)為40cfu/g，殺菌效果較好。對生魚片中大腸埃希氏菌殺滅效果：食醋殺菌效果最佳，而其他3種物質(zhì)的影響情況基本相同，因此選定最佳配方組合為A1B3C1D1，即當食醋8.0mL、芥末1.0mL、AEW 1.0mL、加飯酒1.0mL時，制備復(fù)合殺菌劑殺菌效果最佳。經(jīng)驗證實驗（3個平行）發(fā)現(xiàn)，此組合處理生魚片大腸埃希氏菌數(shù)為50cfu/g，殺菌效果較好。

圖1 不同殺菌劑對于金槍魚生魚片的殺菌效果Fig.1 Antibacterial effect of different condiments on the tuna sashimi

由以上結(jié)果可知，對于金槍魚生魚片中微生物的安全控制，起到殺菌作用的最主要物質(zhì)為食醋和芥末。在金槍魚等各種生魚片食用過程中，保持以8.0mL食醋加入約0.1g芥末（醬）的比例，保證生魚片完全浸沒于組合殺菌劑中8～10s，即可保證生魚片食用安全。相對于食醋和芥末，加飯酒的殺菌效果有限，但在生魚片食用過程中，其可起到一定增效殺菌效果之外，更有益的是可改善生食水產(chǎn)品中的腥味問題，因此可依據(jù)個人需求適當（＜1.0mL）加入。AEW作為一種安全的多功能水，在生食水產(chǎn)品中同樣可起到一定輔助殺菌效果，但添加量過高（≥2.0mL）會輕微影響殺菌調(diào)味料的感官品質(zhì)，因此綜合各影響因素選定金槍魚生魚片最佳殺菌劑組合為：食醋8.0mL、0.1g芥末（醬）、1.0mL酸性電解水及少量加飯酒。AEW更為重要的應(yīng)用價值在于其對于冷凍生魚片在長期凍藏過程中的抑菌作用，以及對于解凍生魚片的短期保鮮應(yīng)用（結(jié)果將另文報道）等。

此外，針對正交實驗獲得的最佳殺菌劑組合，本研究進而采用了風味剖面分析法（GB12310-90），對其蘸食食用風味進行感官評價發(fā)現(xiàn)，金槍魚生魚片蘸食以上殺菌調(diào)味劑組合，無不良風味和強烈刺激性風味出現(xiàn)。經(jīng)消費者嗜好感官檢驗（實驗室內(nèi)部人員組成）發(fā)現(xiàn)，金槍魚生魚片蘸食以上殺菌調(diào)味劑可被大多數(shù)消費者接受。

3 結(jié)論

冷凍金槍魚從解凍、加工至最后進入消費者口中，要經(jīng)歷很多環(huán)節(jié)和較長的時間，根本無法保證整個過程的無菌操作，因此選用有效的微生物控制手段，對于保障消費者的食用安全至關(guān)重要。本文以冷凍金槍魚（鰹魚）為原料，魚肉中細菌總數(shù)和大腸埃希氏菌為研究對象，通過酸性電解水鍍冰衣技術(shù)、不同殺菌劑殺菌效果比較及組合優(yōu)化研究，發(fā)現(xiàn)pH4.5酸性電解水鍍冰衣在80d凍藏期內(nèi)，可顯著抑制魚肉中的微生物繁殖與生長。同時，獲得了金槍魚生魚片的最佳殺菌劑組合，即食醋8.0mL、0.1g芥末（醬）、1.0mL酸性電解水及少量加飯酒，其對生魚片中的微生物殺滅效果顯著，可有效的保證消費者的生食安全需求。

表4 細菌總數(shù)和大腸埃希氏菌數(shù)正交實驗結(jié)果Table 4 Results of orthogonal experiment of total number of bacteria and Escherichia coli

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