疊鞘石斛中聯(lián)芐類化合物的體外抗氧化活性研究

賈芳，夏厚林*，寧梓君，黃萍，黃小燕，唐建軍，張廷模

（1. 成都中醫(yī)藥大學藥學院，中藥材標準化教育部重點實驗室，四川 成都 611137）

活性氧，作為正常代謝的中間體，它們包括超氧陰離子（O2-）、羥自由基（·OH）、過氧化氫（H2O2）和脂質(zhì)自由基（LO·,LOO·,LOOH）。人體中過盛的活性氧將導致細胞膜脂過氧化，損傷DNA和蛋白質(zhì)，并引發(fā)一系列的病理現(xiàn)象[1]。現(xiàn)已知人體與活性氧有關的疾病有60多種。活性氧失調(diào)是很多疾病的共同指標，石斛作為傳統(tǒng)珍貴中藥，在臨床上被廣泛用于治療與人體內(nèi)活性氧代謝失調(diào)有關的慢性萎縮性胃炎、糖尿病、皮膚老化和冠心病等疾病[2]。目前，隨著大規(guī)模的采集，再加資源的更生速度慢，現(xiàn)行藥典收載石斛品種的資源已相當匱乏，而疊鞘石斛作為四川道地藥材，上世紀七十年代后期又曾大力發(fā)展，蘊藏量較大[3]，且已為2010版《四川省中藥材標準》收載。有研究已顯示[4-5]，疊鞘石斛具有增強機體免疫力、抗腫瘤、促進胃酸分泌、抗血小板凝集、降血脂、抗氧化、抗衰老等藥理作用，而這些疾病的產(chǎn)生很大程度上與體內(nèi)活性氧的代謝失調(diào)有關。為此，本實驗首次較系統(tǒng)的研究了疊鞘石斛中聯(lián)芐類化合物抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

疊鞘石斛 由四川萬安石斛產(chǎn)業(yè)開發(fā)有限公司提供，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學藥用植物教研室盧先明教授鑒定為蘭科石斛屬植物疊鞘石斛的干燥莖。藥材60℃烘干，粉碎過50目篩，備用。

大孔樹脂HPD-300 天津海光化工有限公司；1,1-苯基苦基苯肼基自由基（DPPH） 美國Sigma 公司；2,2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（AAPH） 美國Sigma公司；Trolox美國Sigma公司；Flourescein sodium salt（熒光素鈉） 美國Sigma公司；Vitamin C 中國醫(yī)藥集團上海化學試劑公司。

BSA124 S型電子分析天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；PHB-8型pH計 上海隆拓儀器設備有限公司；VARIOSKAN FLASH 2.4.3全波長多功能酶標儀 Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 疊鞘石斛中聯(lián)芐類化合物制備與純化 稱取適量疊鞘石斛藥材粉末，按1:12的比例加入70%乙醇溶液，水浴中回流提取3次，每次120min，抽濾，合并濾液，濃縮至無醇味，加水稀釋調(diào)整為每毫升含生藥1.0g，置于4℃保存?zhèn)溆谩Ｈ∵m當體積藥液，用水稀釋為0.4g生藥/mL，經(jīng)HPD-300型大孔樹脂柱除去雜質(zhì)，吸附飽和后，用5BV蒸餾水洗滌，進一步除雜，用70%乙醇洗脫，洗脫流速為1.0mL/min。收集洗脫液，揮干溶劑后用甲醇定容，參照賈芳等[10]的方法進行測定，得到含有聯(lián)芐類化合物39.75mg/mL的藥液，密封4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 自由基溶液的制備

1.2.2.1 ORAC法反應試劑的制備 精密稱取 0.0024g熒光素鈉置于 100mL棕色瓶中用75mmol/L 的磷酸鉀緩沖液（75mmol/L 的 KH2PO4、75mmol/L 的 K2HPO4）配制成 63μmol/L的溶液，置于 4℃避光保存；AAPH于實驗前精密稱取 0.4883g置于 100mL容量瓶中用75mmol/L 的磷酸鉀緩沖液配制成18.3mmol/L 的溶液；Trolox用75mmol/L 的磷酸鉀緩沖液配制為 10μmol/L的原液，測試前用該緩沖液稀釋成所需濃度。精密稱取 0.1761g VC用75mmol/L 的磷酸鉀緩沖液定容至10mL，臨用前用緩沖液稀釋成所需濃度。

1.2.2.2 DPPH·自由基溶液的制備 精密稱取10.01mg的DPPH，置于10mL棕色容量瓶中，用無水乙醇溶解，定容至刻度搖勻。置4℃避光保存。測試前用無水乙醇稀釋為1×10-4mol·L-1；精密稱取10.03mg VC置于10mL容量瓶中，用無水乙醇溶解，定容至刻度搖勻，臨用前稀釋成所需濃度。

1.2.2.3 超氧陰離子自由基（O2-·）溶液的制備 精密稱取0.0568g鄰苯三酚置于50mL容量瓶中，用蒸餾水溶解定容至刻度，制成9mmol/L 的溶液。

1.2.2.4 羥自由基（·OH）溶液的制備 精密稱取0.0058g硫酸亞鐵置于50mL容量瓶中，用蒸餾水溶解定容至刻度，制成0.75mmol/L 的溶液；精密稱取0.0076g鄰二氮菲置于50mL容量瓶中，用蒸餾水溶解定容至刻度，制成0.75mmol/L 的溶液。

1.2.3 疊鞘石斛中聯(lián)芐類化合物抗氧化活性測定方法

1.2.3.1 對AAPH·的清除作用 本實驗采用的ORAC法測定，參照張雪[6]的方法。

ORAC法需要設兩種對照，即沒有添加 AAPH自由基的熒光素鈉熒光自然衰減對照（-AAPH）和沒有抗氧化劑存在時的自由基作對照（+AAPH）。

1.2.3.2 對DPPH·的清除作用 將不同濃度的供試品溶液100μL和1×10-4mol/L DPPH自由基溶液100μL 加入96孔板中，選擇常用抗氧化劑VC作為陽性對照，配制不同濃度，做相同試驗；同時以不加DPPH自由基（以100μL無水乙醇代替DPPH自由基）的供試品溶液各濃度作為對照以消除供試品本身顏色對測試結果的干擾，并設DPPH自由基陰性對照（以100μL無水乙醇代替供試品），每組平行設四個復孔。將96孔板放入酶標儀中，振蕩1min，并于此條件下保存（室溫，避光），30min后在517nm波長處測定其吸光度值A。按如下公式計算自由基清除率：

式中，A0為DPPH陰性對照組的吸光度；A1為樣品組的吸光度；A2為樣品溶液加無水乙醇對照組的吸光度。

1.2.3.4 對羥自由基（·OH）的清除作用 取30μL 0.75mmol/L的鄰二氮菲溶液加入96孔板中，加入60μL pH=7.4的PBS溶液，加入30μL蒸餾水，充分混勻后，加入30μL 0.75mmol/L的硫酸亞鐵溶液，混勻后，再加入30μL 1%的H2O2混勻。37℃水浴60min后，在536nm處測定其吸光度（A損）；以30μL蒸餾水代替H2O2重復上述操作，測定吸光度（A未損）；以30μL供試品溶液代替30μL蒸餾水重復上述操作，測定吸光度（A供）；只加PBS溶液和供試品溶液，其他試劑以蒸餾水代替補足，重復上述操作，測定吸光度（A參）；只加PBS溶液，其他試劑以蒸餾水代替補足重復上述操作，測定吸光度（A空）。每組平行設四個復孔。按如下公式計算自由基清除率：

·OH 清除率（%）=[( A供- A參- A損- A空)/( A未損- A損)]×100%

2 結果與分析

2.1 對AAPH·的清除作用 聯(lián)芐類化合物和VC不同濃度的熒光衰退曲線，如圖1、2所示。根據(jù)熒光衰退曲線下面積計算方法[7]，可以計算出不同濃度的聯(lián)芐類化合物和 VC的熒光衰退曲線下面積（net AUC），如表1所示。通過分析，隨著濃度的變化，net AUC與濃度之間有良好的線性關系，如圖3、4所示。同時聯(lián)芐類化合物的ORAC值為0.33mg/L，VC的ORAC值為0.21mg/L，即聯(lián)芐類化合物清除AAPH·的能力強于VC。

圖1 聯(lián)芐類化合物不同濃度熒光衰退曲線Fig.1 The FL fluorescent decay curve with different concentration of bibenzyl compounds

圖2 VC不同濃度熒光衰退曲線Fig.2 The FL fluorescent decay curve with different concentration of Vitamin C

表1 聯(lián)芐類化合物的熒光衰退曲線下面積（net AUC）Table 1 The net area under the FL fluorescent decay curve (net AUC)of bibenzyl compounds

圖3 不同濃度聯(lián)芐類化合物與net AUC的線性關系Fig.3 The linear relationship between net AUC and bibenzyl compounds concentration

圖4 不同濃度VC與net AUC的線性關系Fig.4 The linear relationship between net AUC and Vitamin C concentration

2.2 對 DPPH·的清除作用 聯(lián)芐類化合物和 VC對DPPH·的清除作用如表2，從表中可以看出，兩者清除 DPPH·的能力隨著濃度增大而增大，聯(lián)芐類化合物有較強的清除能力，但弱于VC。

表2 聯(lián)芐類化合物對DPPH·的清除作用（%，±s，n=4）Table 2 Scavenging activity of bibenzyl compounds against DPPH· （%，±s，n=4）

表2 聯(lián)芐類化合物對DPPH·的清除作用（%，±s，n=4）Table 2 Scavenging activity of bibenzyl compounds against DPPH· （%，±s，n=4）

質(zhì)量濃度（mg/L） DPPH·清除率（%） 質(zhì)量濃度（mg/L） DPPH·清除率（%）聯(lián)芐類化合物 VC 39.75 38.00±0.55 1.00 21.37±0.50 79.50 56.16±0.67 1.00 38.43±0.52 99.38 65.87±0.86 2.50 45.41±0.62 198.75 83.90±0.51 5.00 75.14±0.34 596.25 86.03±0.82 15.00 97.20±0.71

通過SPSS 17.0軟件，采用曲線擬合法得到疊鞘石斛中聯(lián)芐類化合物清除DPPH·的曲線回歸方程為：y=12.415+0.751x-0.002x2+2.410×10－6x3，R2=1.000，F(xiàn)=455358.35，p≤0.001，半數(shù)清除率（EC50）為 62.89mg/L ；VC清除 DPPH·的曲線回歸方程為：y=4.720+17.743x-0.772x2，R2=1.000，F(xiàn)=3992.46，p≤0.001，半數(shù)清除率（EC50）為 3.44mg/L。聯(lián)芐類化合物的 EC50約為VC的18倍。

2.3 對超氧陰離子自由基（O2-·）的清除作用 聯(lián)芐類化合物和VC對O2-·的清除作用如表3。在實驗濃度范圍內(nèi)，兩者對O2-·的清除作用呈明顯的量效關系，隨著質(zhì)量濃度的增大，清除作用不斷增大。

表3 聯(lián)芐類化合物對O2-·的清除作用（%，±s，n=4）Table 3 Scavenging activity of bibenzyl compounds against· （%，±s，n=4）

表3 聯(lián)芐類化合物對O2-·的清除作用（%，±s，n=4）Table 3 Scavenging activity of bibenzyl compounds against· （%，±s，n=4）

質(zhì)量濃度（mg/L） O2-·清除率（%） 質(zhì)量濃度（mg/L） O2-·清除率（%）聯(lián)芐類化合物 VC 397.50 50.78±0.07 25.00 66.11±0.09 596.25 58.38±0.05 50.00 73.76±0.02 795.00 69.68±0.08 75.00 78.15±0.08 993.75 79.70±0.07 100.00 86.65±0.04 1987.50 82.41±0.07 150.00 91.14±0.05

通過SPSS 17.0軟件，采用曲線擬合法得到疊鞘石斛中聯(lián)芐類化合物清除·的曲線回歸方程為：y=25.429+61.598x-8.326x3，R2=0.989，F(xiàn) =93.57，p≤0.05，半數(shù)清除率（EC50）為 408.10mg/L ；VC清除·的曲線回歸方程為：y=62.170+0.111x-0.003x2 ，R2=0.99，F(xiàn)=33.00，p≤0.05，半數(shù)清除率（EC50）為 14.04mg/L。聯(lián)芐類化合物的 EC50約為 VC的 29倍。

2.4 對羥自由基（·OH）的抑制作用 聯(lián)芐類化合物和VC對·OH的抑制結果見表4。在所選濃度范圍內(nèi)，一定濃度的聯(lián)芐類化合物高于對照VC抑制·OH的能力，VC的抑制率很小，在一定濃度范圍內(nèi)抑制率幾乎沒有變化。但是總體來看，疊鞘石斛中聯(lián)芐類化合物抑制·OH釋放的能力還是較VC弱。

表4 疊鞘石斛中聯(lián)芐類化合物對·OH的抑制作用（±s，n=4）%Table4 Inhibiting activity of bibenzyl compounds against ·OH（±s，n=4）%

表4 疊鞘石斛中聯(lián)芐類化合物對·OH的抑制作用（±s，n=4）%Table4 Inhibiting activity of bibenzyl compounds against ·OH（±s，n=4）%

質(zhì)量濃度（mg/L） ·OH抑制率（%） 質(zhì)量濃度（mg/L） ·OH抑制率（%）聯(lián)芐類化合物VC 993.75 9.78±0.01 50.00 13.17±0.02 1987.50 13.22±0.04 75.00 13.39±0.02 2981.25 14.73±0.02 100.00 13.94±0.01 3975.00 21.59±0.04 150.00 14.11±0.01 5962.50 36.77±0.08 200.00 15.35±0.01

通過SPSS 17.0軟件，采用曲線擬合法得到疊鞘石斛中聯(lián)芐類化合物抑制·OH的曲線回歸方程為：y=9.731+8.332×10-7x2，R2=0.994，F(xiàn) =173.142，p≤0.05，半數(shù)清除率（EC50）為7.86mg/mL ；VC抑制·OH 的曲線回歸方程為：y=11.084x+1.488×10-6x3，R2=0.980，F(xiàn)=16.736，p≥0.1，半數(shù)清除率（EC50）為 1.89mg/mL。聯(lián)芐類化合物的 EC50約為 VC的 4倍。

3 結論與討論

DPPH在溶液中生成一個穩(wěn)定的含氮自由基，且該溶液呈典型的紫色，在紫外-可見光區(qū)517 nm波長處具有較強的吸收。當DPPH溶液中加入抗氧化劑時，由于其自由基清除作用使溶液紫色消退，導致吸光強度隨抗氧化劑量的增加而減弱，通過加入抗氧化劑前后，吸光度的變化來計算自由基的清除作用[8]。本試驗研究了不同濃度聯(lián)芐類化合物對DPPH·的清除作用，在 39.75～596.25mg/L濃度范圍內(nèi)，隨著聯(lián)芐類化合物濃度的增加清除作用增加明顯，當聯(lián)芐類化合物濃度增至198.75mg/L以上時，其對DPPH·的清除作用強于VC。

ORAC法的基本原理與 DPPH·清除法類似。通過試驗發(fā)現(xiàn)，隨著供試品含量的增大，熒光衰退曲線下面積在增大，且與濃度呈現(xiàn)良好的線性關系，同時表現(xiàn)出比 VC更強的AAPH·清除能力。

鄰苯三酚在堿性條件下發(fā)生自氧化反應[9]，產(chǎn)生穩(wěn)定濃度的超氧陰離子自由基（O2-·）與中間物，中間物又與超氧陰離子自由基（O2-·）反應，得到一種帶有顏色的中間產(chǎn)物，該產(chǎn)物在紫外有吸收，引起某一波長處吸光值的變化，來反應抗氧化劑的清除能力的大小。本試驗結果在 397.5～1987.5mg/L濃度范圍內(nèi)，隨著聯(lián)芐類化合物含量的增大，清除超氧陰離子自由基（O2-·）的能力在增強，與該方法原理相符，但相較于VC疊鞘石斛中聯(lián)芐類化合物清除作用較弱。

Fenton反應體系的基本原理與ORAC法的相當，即抗氧化劑與鄰二氮菲競爭與羥自由基（·OH）結合，由于抗氧化劑的存在而抑制了羥自由基（·OH）對鄰二氮菲紅色配合物的氧化。本試驗結果在993.75～5962.5mg/mL濃度范圍內(nèi)，隨著聯(lián)芐類化合物含量的增大，抑制羥自由基（·OH）的能力在增強。但從半數(shù)清除率（EC50）比較抑制作用弱于VC。

可見，聯(lián)芐類化合物具有較強的AAPH自由基清除能力，還具有清除DPPH自由基和超氧陰離子自由基和抑制羥自由基的能力。且在各試驗濃度范圍內(nèi)，聯(lián)芐類化合物的濃度和自由基清除率呈現(xiàn)良好的劑量依賴關系。聯(lián)芐類化合物對各自由基的半數(shù)清除率（EC50）不同，可能與聯(lián)芐類化合物中具體的單體物質(zhì)對不同自由基作用的不同而導致，而該聯(lián)芐類化合物中個單體化合物的含量可能又存在差異。

綜上可知，疊鞘石斛中聯(lián)芐類化合物具有很好的抗氧化活性，可以作為天然抗氧化劑清除體內(nèi)正常代謝產(chǎn)生的羥自由基、超氧陰離子等活性氧自由基，避免自由基失衡誘發(fā)各種疾病，為疊鞘石斛聯(lián)芐類化合物的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

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