蘋果汁和桃汁種類特異性PCR檢測方法的研究

孫建霞，白衛濱 ，曹春廷，張振華，邱瑞霞，吳希陽，歐仕益

(1.廣東工業大學輕工化工學院，廣東廣州510090;2.暨南大學食品科學與工程系，廣東廣州510632)

DNA分子檢測方法是從基因水平鑒別品種的一種手段，采用PCR技術擴增種類特異性基因進行成分鑒定，可以不受時間和環境影響，又能從基因水平直接反映不同種類間差異，是快速可行、高效準確的方法。在PCR技術誕生的20多年里，隨著分子生物學研究的不斷深入和發展，分子生物學手段為各種水果的遺傳研究和育種工作提供了有利工具。研究者在對水果的遺傳特性研究基礎上，建立了各種水果的基因庫，但卻很少應用于果汁分子水平種類鑒定。蘋果汁主要的摻假現象有三種，即廉價果汁摻假，糖類及水的摻假和調配蘋果汁摻假［1］。目前，大多數鑒別摻假果汁的方法均為對各種水果特有的標志性化合物檢測。Versari等［2］將蘋果汁中酮類物質作為標志性化合物用反相高效液相色譜法進行摻假檢測。劉溫喜［3］針對蘋果汁中的多酚類物質和D，L-蘋果酸用超高效液相色譜法鑒別摻假的濃縮蘋果汁。胡耀星等［4-5］分別從糖、有機酸、氨基酸、穩定性同位素、類黃酮、陽離子及光譜學等方面采用不同檢測方法對蘋果汁的摻假進行了檢測。同時，Kuchemnko等［6］用電壓諧振器對蘋果芳香組成的揮發性物質進行摻假檢測。Wald B等［7］將存在于用梨汁摻假的蘋果汁而不存在于純蘋果汁的異鼠李素葡萄糖苷作為標志性化合物。Muntean［8］首次同時使用碳水化合物色譜和離子色譜分離蘋果汁中4種主要的碳水化合物和6種陽離子來檢測果汁的摻假。Lukas等［9］根據橘汁中代謝組指紋來檢測橘汁中摻假的蘋果汁和葡萄柚汁。然而，果汁中所含有的標志化合物是不恒定的，外界環境和加工條件都會影響其含量，因此，用理化方法對果汁進行鑒偽具有局限性。隨著無損檢測的興起，也有不少人將紅外光譜法應用于果汁摻假檢測。Lorenzo等［10-11］用紅外光譜法對摻雜各種糖類物質的蘋果汁單一建模來檢測。而Luis等［12］用紅外光譜對蘋果汁中的碳水化合物建模來檢測糖類物質的摻假。高志明等［13］對蘋果汁摻假梨汁用紅外光譜法檢測。紅外光譜法雖然具有快速無損等特點，但是其數據模型制作麻煩且只能針對一種摻假物質檢測。分子生物學技術在果汁鑒偽方面的應用不多，Chang等［14］用分子生物學方法鑒定鮮榨和還原橙汁。韓建勛等［15］實時熒光PCR對常見果汁中梨摻假現象檢測，但此研究并未涵蓋除梨汁以外其他果汁的摻假。

表2 蘋果和桃特異性引物Table 2 Specific primers of apple and peach

本研究通過NCBI數據庫，篩選蘋果和桃特異性基因，進而根據該特異性基因確定特異性擴增引物，使其能在基因水平上反映水果種類的差異，并應用于蘋果汁和桃汁的鑒偽研究，該方法不受其他遺傳效應和環境條件的影響，具有在蘋果和桃深加工產品中區分成分的實際應用價值，具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘋果和桃 均購于超市，4℃保存，樹種與品種見表1;梨、柑橘、番木瓜、櫻桃和草莓等 由華南農業大學農業與生物學院饋贈;rTaq酶、dNTPs、PCR緩沖液、溴化乙錠、分子量Marker(100～2000bp) 大連寶生物公司;CTAB、SDS、PVP、β-巰基乙醇、EDTA、Tris飽和苯酚 Sigma公司;其余化學試劑 北京分析儀器廠。

表1 實驗材料Table 1 Test material

微量移液器 德國Eppendorf公司;ABI 2720 thermal cycler(Applied Biosystems)PCR擴增儀 美國ABI公司;D640核酸蛋白分析儀 美國Beckman公司;Gel Doc1000凝膠成相系統 美國Bio Rad公司;5804R型低溫高速離心機 Ependoff公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 改良CTAB法提取DNA 果肉DNA的提取。取經液氮磨碎的蘋果、桃、梨、柑橘、番木瓜、櫻桃和草莓 200mg，各加入 2mL離心管中;加入 1000μL CTAB溶液，振蕩均勻，65℃溫育40min，1200r/min離心10min，吸取上清;加入等體積酚:三氯甲烷:異戊醇(25∶24∶1)，振蕩均勻，1200r/min 離心 10min。吸取上清液，加入另一新管中，再加入等體積酚:三氯甲烷:異戊醇(25∶24∶1)，振蕩均勻，1200r/min 離心10min;吸取上清加入等體積三氯甲烷:異戊醇(24∶1)，吸取上清;加入2/3體積的異丙醇，-80℃沉淀20min或-20℃沉淀2h，1200r/min離心10min;棄去上清液，加入70%乙醇溶液洗滌，12000r/min離心2min。棄去上清液，干燥，用50μL TE溶液溶解沉淀;加入2μL RNA酶溶液，37℃溫育30min;-20℃保存，備用。蘋果汁和桃汁DNA的提取。取鮮榨果汁1mL，分別取1mL 100%各加入10mL離心管;加入4mL CTAB(加3.3%聚乙烯吡咯酮(K30)PVP)溶液，其余步驟與上同。

1.2.2 蘋果和桃保守序列的確定 根據NCBI數據庫公布的基因序列，查找蘋果屬和桃屬特異性的基因，通過篩選得到蘋果屬抑制蛋白的mal d 4.02基因(登錄號FM887031.1)，桃屬微衛星標記MA023a(登錄號AB077132.1)，通過BLAST比較具有品種特異性，同時以植物高度保守的葉綠體AccD基因(登錄號EU326013.1)作為內標。

1.2.3 蘋果和桃特異性引物的設計與篩選 據NCBI的引物在線設計軟件結合BLAST比對，通過PCR擴增驗證篩選獲得蘋果、桃特異性引物如表2所示。為了驗證蘋果和桃的定性PCR體系的特異性，同時以富士、紅星、小國光、肥桃、水蜜桃、寒露桃、鴨梨、雪花梨、黃金梨、蜜桔、紅桔、沙糖桔、番木瓜、櫻桃、草莓基因組DNA為模板進行擴增。

1.2.4 特異性引物的PCR擴增條件 擴增采用反應體系為 30μL，含 1×PCR 緩沖液(50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl，pH8.3，1.5mmol/LMgCl2)，0.2mmol/L dNTPmix，0.3μmol/L 引 物 GT1F 和GT1R，2.5 U Taq DNA聚合酶，100ng基因組 DNA。擴增程序為:預變性(5min/94℃);40循環:變性(30sec/94℃)，退火(30s/58℃)延伸(30s/72℃);延伸(5min/72℃)。反應結束后取5μL PCR產物于2%的瓊脂糖凝膠，1×TAE緩沖液中，穩壓90V電泳30min，在紫外凝膠成像系統下檢測。

1.2.5 PCR擴增產物測序 蘋果和桃PCR擴增特異性產物送上海生工(北京)測序。

1.2.6 特異性引物的PCR擴增靈敏度分析 分別以富士蘋果、水蜜桃的DNA為模板，按照100、50、25、10、5、2.5、0ng/μL 的模板添加量，參照 1.2.4 的反應體系和最佳退火溫度進行PCR擴增，擴增結果在2%的瓊脂糖凝膠中檢測。

2 結果與分析

2.1 蘋果和桃引物種類特異性的定性檢測

根據NCBI數據庫篩選設計的特異性的引物，優化PCR條件，建立蘋果、桃種類特異性的定性檢測體系，同時驗證體系的特異性和靈敏度。

結果顯示，擴增產物為242bp的ACC內源參照基因在所有擴增模板的體系中均有預期條帶出現(圖1)。這說明PCR體系沒有受到抑制。大小為129bp的擴增條帶，僅在以富士、紅星、小國光為模板的時候出現;大小為179bp的擴增條帶，僅在以肥桃、水蜜桃、寒露桃為模板的時候出現;而以其它非種類特異性水果為模板時，沒有出現相應的擴增條帶(圖2，圖3)。

圖1 通用內標基因ACC擴增結果Fig.1 Amplification results of the endogenous gene ACC

由圖1～圖3可知，蘋果和桃種特異性的擴增產物生工測序結果與理論序列一致，表明結果的可靠性。

2.2 蘋果、桃、梨、柑橘種類特異性的PCR引物靈敏度

為了驗證該蘋果、桃、梨、柑橘的種類特異性引物的 PCR 靈敏性，分別稀釋成 100、50、25、10、5、2.5、0ng/μL的模板DNA，以這些DNA樣品為模板進行擴增。結果如圖4、圖5所示。

結果表明蘋果、桃屬特異性引物的最低檢測限分別為5、10ng/μL。

圖2 蘋果屬特異性引物定性檢測結果Fig.2 The qualitative detection results of malues-specific primers

圖3 桃屬特異性引物定性檢測結果Fig.3 The qualitative detection results of amygdalus-specific primers

圖4 蘋果屬特異性引物定性檢測的靈敏度Fig.4 The qualitative detection sensitivity of malues-specific primers

通過驗證定性檢測體系的特異性和靈敏性，說明蘋果、桃屬特異性引物在分子水平鑒定蘋果、桃是可行的。這將為今后這兩種水果的深加工產品提供技術支持。

2.3 蘋果和桃鮮榨汁的應用檢測

通過優化改進的CTAB法提取的鮮榨汁的基因組DNA，進行ACC內標基因、蘋果汁和桃汁種類特異性基因的擴增，擴增結果見表3。

圖5 桃屬特異性引物定性檢測的靈敏度Fig.5 The qualitative detection sensitivity of amygdalus-specific primers

從表3的擴增結果可以看出，7種鮮榨果汁僅僅富士蘋果汁和水蜜桃汁的相對應種屬特異性陽性擴增。表明此方法可以很好的應用于蘋果汁和桃汁的種屬特異性檢測。

表3 蘋果和桃鮮榨汁的種類特異性基因的擴增結果Table 3 Amplification results of the apple and peach fresh juice species-specific gene

3 結論與討論

普通PCR方法是目前分子檢測的最主要手段之一。它具有快速、高效、準確、靈敏、操作簡單、成本低廉等優點，適用于開展水果種類特異性的鑒定。本研究以ACC基因為通用內標，建立了蘋果、桃屬種類特異性鑒定方法，并通過引物特異性驗證實驗進一步證實了該方法準確性。內標基因的設定，排除了由于DNA質量以及實驗操作等因素對檢測結果可靠性的影響，避免了假陰性結果的發生。

通過蘋果、桃屬特異性引物的PCR擴增條件的優化，兩種水果引物的特異性PCR擴增和PCR靈敏度分析表明，蘋果、桃屬特異性引物除對各自屬擴增出目的性條帶外，對其它屬均沒有條帶擴增，特異性引物的靈敏度均較高。因此，蘋果、桃屬種類特異性檢測方法具有穩定性好、特異性強和靈敏度高的特點，適用于蘋果、桃屬種類鑒定并成功應用于蘋果汁和桃汁的種屬鑒定，具有重要應用價值。然而此方法僅能用來定性檢測一大類物質，但對種屬內的不同品種產品不能區分，而且也不能進行定量測定，因此，下一步需建立蘋果汁和桃汁的定量檢測方法研究。

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