乳腺癌組織HER-2擴增狀態及其與組織微血管生成擬態的相關性

沈溪明，郭友逢，何欣欣，孫 倩，陳耿標，葉 明，曾韻潔

(中山大學附屬第二醫院，廣州510120)

血管生成擬態(VM)是腫瘤細胞形成的可以運送血液和營養物質的管道樣結構，是腫瘤組織內除血管外的另一種血液供應方式。研究發現，VM與腫瘤的進展及患者預后存在密切關系［1］。人類表皮生長因子受體2(HER-2)是判斷乳腺癌患者預后的重要因子［2，3］。但HER-2蛋白表達及基因擴增與乳腺癌患者VM的相關性尚不清楚。2012年10月～2013年6月，我們觀察了乳腺癌組織中HER-2蛋白表達和基因擴增狀態及VM表現，探討三者之間的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取中山大學附屬第二醫院病理科存檔的乳腺癌石蠟標本200例，均為女性，年齡42～85(50.24 ±9.57)歲，腫瘤直徑(3.54 ±0.21)cm。病理類型:乳腺浸潤性導管癌176例，乳腺小葉癌18例，乳腺髓樣癌4例，其他2例。所有患者術前均未接受化療或基因治療。

1.2 觀察項目

1.2.1 VM病理改變 采用CD34和PAS雙重染色法。常規石蠟切片，脫水后EDTA抗原修復，根據免疫組化Envision二步法常規行 CD34染色，DAB顯色，鏡下觀察內皮細胞著色后終止顯色，行PAS復染，蒸餾水沖洗，蘇木精染核，封片。VM通道內無內皮細胞襯覆，通道外基底膜PAS染色為陽性。

1.2.2 HER-2蛋白表達 采用免疫組化法。常規石蠟切片，二甲苯脫蠟后梯度酒精脫水，EDTA抗原修復后PBS沖洗，滴加HER-2抗體孵育1 h，PBS沖洗，滴加廣譜二抗，常溫下孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染。HER-2蛋白陽性為細胞膜呈棕褐色。細胞膜完整或不完整著色或陽性細胞數＞10%為陽性。細胞膜未著色或陽性細胞數＜10%為陰性。

1.2.3 HER-2基因擴增 采用熒光原位雜交法。常規石蠟標本切片，脫蠟、水化，30%酸性亞硫酸、SSC緩沖液沖洗，蛋白酶K漂洗，0.1 mmol/L HCl漂洗，酒精脫水，丙酮浸泡3 min，將10 μL變性的DNA探針混合物與樣本雜交，蓋玻片覆蓋后置于42℃濕盒中孵育過夜，用50%甲酰胺和SSC緩沖液各沖洗3次，沖洗后滴加10 μL DAPI復染細胞核，400倍光鏡下觀察。正常細胞核存在1個綠色和1個紅色信號。若單個細胞核中紅色≥2個，但紅色信號/綠色信號值(50個細胞核)＜1.8為無HER-2基因擴增;1.8～2.2為可疑，需增加選擇計數的細胞數至100個;＞2.2為基因擴增陽性。

1.2.4 相關性分析及與臨床病理參數的關系 分析HER-2蛋白表達、基因擴增與VM的相關性，分析三者與乳腺癌患者臨床病理參數的關系。

1.3 統計學方法 采用SPSS16.0統計學軟件分析數據，兩組計數資料比較采用χ2檢驗，相關性分析采用四格表χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 VM病理觀察 由腫瘤細胞圍成的不規則管道樣結構，無內皮細胞襯覆，CD34染色陰性，PAS陽性，可見淡紅色基底膜，管腔內存在紅細胞，周圍無炎性或壞死組織。乳腺癌組織中VM總陽性率為49.0%(98/200)。

2.2 HER-2蛋白表達及基因擴增情況 乳腺癌組織中HER-2蛋白陽性率和基因擴增率分別為67.5%(135/200)、19.0%(38/200)。

2.3 HER-2蛋白表達、HER-2基因擴增、VM陽性率與臨床病理參數的關系 HER-2蛋白表達及HER-2基因擴增與腫瘤直徑和組織學分級相關(P均＜0.05)，VM陽性與淋巴結轉移和組織學分級相關(P均＜0.05)。見表1。

表1 HER-2蛋白表達、HER-2基因擴增、VM與乳腺癌臨床病理特征的關系(例)

2.4 HER-2表達、基因擴增與VM的關系 乳腺癌VM陽性組中，HER-2蛋白及基因擴增陽性率明顯高于VM陰性組(P均＜0.05)，見表2。

3 討論

長期以來，內皮細胞形成的新生血管被認為是腫瘤細胞獲得血液支持的惟一途徑。但近年研究發現，單純的抗腫瘤性血管形成治療并沒有顯著改善患者的預后，仍有半數以上患者存在復發而死亡［4］。VM是近年來提出的全新的腫瘤性血管形成模式，是獨立于內皮細胞形成血管的另一種腫瘤性微循環模式，具有運輸血液和營養物質的功能，但沒有內皮細胞襯覆，由腫瘤細胞圍繞形成不規則管道，可與宿主的微血管相通，從而滿足腫瘤的惡性生長、侵襲的需要，為腫瘤細胞的遠處轉移提供機會［5］。研究表明，在人體多種腫瘤如肝癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌和黑色素瘤中均存在VM的表達［6～8］。張旭等［9］研究發現，VM陽性的乳腺癌患者遠期生存率明顯低于VM陰性患者，復發率明顯高于VM陰性患者。導致這一現象的原因可能是VM陽性患者腫瘤細胞更容易進入血液系統發生遠處轉移，患者預后差。此外，可以形成VM的腫瘤組織惡性程度比較高，分化低，更具有未分化或分化不成熟的表現［10］。本研究發現，在200例乳腺癌組織中VM陽性率為69.0%，VM陽性與乳腺癌患者淋巴結轉移和組織學分化程度密切相關，而與乳腺癌患者年齡、腫瘤大小等無明顯相關。

表2 HER-2表達、基因擴增與VM的關系(例)

HER-2是參與腫瘤生長、分化和侵襲轉移等生物學行為的重要因子。研究發現，乳腺癌組織中HER呈高表達，并參與腫瘤的增殖與凋亡［11］。本研究發現，乳腺癌組織中HER-2蛋白陽性率和基因擴增率分別為67.5%和19.0%，兩者均與腫瘤大小和組織學分級相關，而與患者年齡和淋巴結轉移無關;另外，本研究發現，HER-2與VM存在密切相關性，VM陽性者中HER-2陽性表達率明顯高于VM陰性者，提示HER-2可以通過激活下游相關基因促進與VM相關的分子表達。國外有研究通過體外實驗證實，在HER-2基因存在的情況下，腫瘤細胞可圍繞形成血管樣，而敲除HER-2基因后，腫瘤細胞相關的VM則不能形成或形成能力較弱［12，13］。研究認為其可能機制是HER-2通過活化酪氨酸激酶，促進細胞內信號傳導，激活相關基因，并促進細胞糖代謝、氧運輸和腫瘤性血管形成過程中的相關靶基因，從而通過啟動一系列分子事件，促使腫瘤不斷形成腫瘤性血管以保證腫瘤生長所需的血液供應，促進VM形成［14］，因此，HER-2可能是 VM 形成和腫瘤惡性生長的促進因素。

目前關于HER-2促進VM的具體機制尚不清楚，本研究后續將從細胞學水平進一步研究，為乳腺癌提高更新的診療思路。

［1］孫保存，張詩武，趙秀蘭，等.惡性黑色素瘤血管生成擬態的研究［J］.中華病理學雜志，2003，32(6):539.

［2］ Zhang S，Zhang D，Sun B.Vasculogenic mimicry:current status and future prospects［J］.Cancer Lett，2007，254(2):157-164.

［3］趙坡，姜學革.FISH檢測乳腺癌HER-2基因擴增及17號染色體多體狀況及其臨床病理學意義的分析［J］.中華腫瘤防治雜志，2011，18(9):680-683.

［4］Sher I，Adham SA，Petrik J，et al.Autocrne VEGF-A/KDR loop protects epithelial ovarian carcinoma cells from anoikis［J］.Int J Cancer，2009，124(3):553-557.

［5］Sun B，Zhang S，Zhang D.Vasculogenic mimicry is associated with high tumor grade，invasion and metastasis，and short survival in patients with hepatocellular carcinoma［J］.Oncol Rep，2006，16(4):693-698.

［6］王曉宇，王琳谷，彥軍，等.睪丸生殖細胞惡性腫瘤血管生成擬態的研究和預后相關性分析［J］.中國腫瘤臨床，2009，36(2):78-82.

［7］王俊艷，王立，孫濤，等.VEGF2α誘導對卵巢癌血管生成擬態形成及侵襲、遷移能力的影響［J］.中國組織化學與細胞化學雜志，2011，20(1):48-52.

［8］汪曉慶，吳強，張詩武，等.胃腺癌血管生成擬態的形態學觀察和MMP-2表達［J］.臨床與實驗病理學雜志，2010，26(6):670-676.

［9］張旭，陳宣世，劉俊.乳腺癌血管生成擬態與MVD、MMP-2表達及預后的關系［J］.現代醫藥衛生，2007，23(18):2693-2695.

［10］劉維燕，史榮亮，陳前.血管生成擬態在乳腺癌中的表達及其意義［J］.蚌埠醫學院學報，2011，36(3):235-237.

［11］江建軍，田延鋒，趙增仁.乳腺癌組織中 Nup88、PINCH mRNA表達與 HER-2的相關性研究［J］.山東醫藥，2012，52(40):40-43.

［12］Enholm B，Karpanen T，Jeltsch M，et al.Adenoviral expression of vascular endothelial growth factor-C induces lymphangiogenesis in the skin［J］.Circ Res，2007，88(2):623-629.

［13］Guzman G，Cotler SJ，Lin AY.A pilot study of vasculogenic mimicry immunohistochemical expression in hepatocellular carcinoma［J］.Arch Pathol Lab Med，2007，131(12):1776-1781.

［14］李偉，羅彥英，辛芝，等.胃腺癌組織中HER-2蛋白表達及其與微血管密度的關系［J］.山東醫藥，2013，53(28):45-47.