嬰兒配方乳粉中甘油三脂Sn-2脂肪酸的測定

賈云虹，李朝旭，房新平，楊凱

（河北三元食品有限公司研發(fā)部，河北石家莊050071）

母乳是嬰兒成長最好的食物，但是，因各種原因不能母乳喂養(yǎng)或母乳供應不足以及嬰兒在6個月以后和斷奶期需要增加輔食的情況下，嬰幼兒配方乳粉成為可供選擇的最佳食品之一。嬰幼兒配方乳粉從開始研究至今已有近100年的歷史，其研制進程也逐漸由宏觀調整走向了微觀調整。脂肪作為嬰幼兒配方乳粉中的重要營養(yǎng)素，也正經歷著由脂肪酸組成接近到脂肪結構接近母乳，向無限趨近母乳的方向更進了一步[1]。從宏觀上看，作為嬰幼兒配方乳粉重要原料的牛乳和人乳的脂肪含量相近，但從微觀上看，它們的脂肪酸位置分布卻有著很大的差異。

人乳中最重要的飽和脂肪酸—棕櫚酸，大約有70%是酯化在甘油三酯分子2-位上。而牛乳以及絕大多數市場上銷售的嬰幼兒配方奶粉中所用的植物油脂里的棕櫚酸則是連在1-或3-位上（2-位上的量少于20%）[2-5]。這種甘油三酯中的棕櫚酸會在小腸內被胰酯酶水解，形成游離態(tài)脂肪酸，并與鈣元素結合生成鈣皂，造成嬰幼兒體內存在大量供能物質——棕櫚酸以及鈣元素的流失[5]。所以，世界各大嬰幼兒乳粉生產企業(yè)都在研究如何進一步調整配方乳粉中2-位棕櫚酸的含量，以使以牛乳為基礎原料的嬰幼兒配方乳粉更加適合寶寶食用，但在嬰幼兒配方乳粉中2-位脂肪酸的檢測上國內的研究還很少。

國外對甘油三酯脂肪酸位置分布的研究已經很多，但基本步驟都是采用酶或化學試劑對甘油三酯進行部分水解，然后用操作復雜、費時費力的薄層色譜法（TLC）分離純化2-位單甘脂，直接或衍生后用氣相色譜（GC）測定[6-7]。國內，GB/T 24894-2010《動植物油脂甘三脂分子2-位脂肪酸組分的測定》對動植物油脂2-位脂肪酸組分的測定進行了規(guī)定[8]，也是采用TLC法對2-位單甘脂進行分離；趙海珍等采用高效液相色譜法對豬油甘油三酯的脂肪酸位置分布進行了測定，但2-位上的脂肪酸組成是通過間接方式計算而得，影響了結果的準確性[9]。這些方法多是用于動植物油脂的甘油三酯脂肪酸組成的測定，對嬰幼兒乳粉脂肪中甘油三酯2-位脂肪酸組成測定的報道很少。

本研究用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）代替?zhèn)鹘y的TLC法分離純化嬰兒配方乳粉脂肪中2-位單甘酯，對單甘酯進行甲酯化衍生后，用氣相色譜儀分析2-位脂肪酸組成和含量。

1 材料與方法

1.1 材料

棕櫚酸甘油一酯（99%）、棕櫚酸甘油二酯（≥99%）、棕櫚酸甘油三酯（99%）、棕櫚酸（≥99%）、37種脂肪酸甲酯標準品（10 mg/mL）、豬胰脂酶：sigma公司；正己烷、乙腈、甲醇、二氯甲烷、色譜純；其余試劑為分析純。三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液：1 mol/L，用6 mol/L鹽酸調至pH=8；膽酸鈉溶液：1 g/L；氯化鈣溶液：220 g/L。

1.2 設備

Agilent 1100高效液相色譜系統：配有蒸發(fā)光散射檢測器和餾分收集系統，美國安捷倫公司；Agilent 7890氣相色譜儀：配有FID檢測器，美國安捷倫公司；SP-2560氣相色譜柱：西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；氨基色譜柱：大連依利特公司；RE-52型旋轉蒸發(fā)儀：上海博通化學科技有限公司；DSY-Ⅲ氮吹儀：北京東方精華苑科技有限公司；恒溫水浴鍋：余姚市東方電工儀器廠；XW-80A渦旋振蕩器：上海精科實業(yè)有限公司；TDL-5離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 乳粉脂肪的提取

采用ISO14156（IDF172）規(guī)定的方法提取乳脂肪[10]。

1.3.2 乳脂肪甘油三酯1、3位脂肪酸的水解

稱取0.1 g試樣于10 mL離心管中，加入約30 mg脂肪酶和2 mL緩沖溶液，小心搖動，然后加入0.5 mL膽酸鈉溶液和0.2 mL氯化鈣溶液，蓋上塞子小心搖動，立即將離心管放入40℃水浴鍋中，保持手搖（60±2）s。從水浴鍋中取出離心管，在40℃下，用振蕩器劇烈震蕩（120±2）s。立即加入1 mL鹽酸和1 mL二氯甲烷，用振蕩器劇烈震蕩。離心分離，用注射器將有機層轉移，并用0.45 μm濾膜過濾到液相色譜樣品瓶中備用。

1.3.3 液相色譜分離制備單甘脂

1.3.3.1 色譜條件

流動相：乙腈（含0.1%冰乙酸）∶二氯甲烷=50∶50；色譜柱：氨基柱 4.6 mm×250 mm，5 μm；柱溫：40 ℃；流速：1 mL/min；蒸發(fā)光散射檢測器：漂移管70℃，霧化氣壓力：0.3 MPa。

1.3.3.2 色譜分離單甘脂

注入40 μL單甘脂標準品于液相色譜儀，確定單甘脂的保留時間，然后 注入40 μL樣品于液相色譜儀，根據單甘脂保留時間收集單甘脂餾分。

1.3.4 單甘脂甲酯化

將收集的單甘脂用氮吹儀吹干，加入1 mL正己烷溶解，加入0.2 mL氫氧化鉀甲醇（2 mol/L）溶液，劇烈震搖2 min，靜置分層，將正己烷層轉移至氣相色譜樣品瓶。

1.3.5 氣相色譜分析2-位脂肪酸

分別注入1 μL脂肪酸甲酯標準品和1 μL樣品于氣相色譜儀，根據37種脂肪酸標準品的保留時間定性樣品中各脂肪酸，用色譜峰面積歸一法定量。氣相色譜條件：參考GB 5413.27-2010《嬰幼兒食品和乳品中脂肪酸的測定》[11]。

2 結果與討論

2.1 乳粉脂肪提取方法的選擇

分別采用羅茲哥特里法、酸水解法、氯仿甲醇法和ISO14156（IDF172）規(guī)定的方法提取乳粉中的脂肪，結果發(fā)現羅茲哥特里法、酸水解法、氯仿甲醇法不但操作過程繁瑣，而且脂肪提取量少，不利于下一步的分析使用，而ISO14156《乳和乳制品中脂肪和脂溶性物質的提取方法》，操作省時、簡便，提取的脂肪量大，便于下一步的分析。

2.2 液相色譜分離制備單甘脂條件的確定

2.2.1 色譜柱的選擇

分別采用正相硅膠柱和反相C18柱、氨基柱分離棕櫚酸甘油一酯、棕櫚酸甘油二酯、棕櫚酸甘油三酯、棕櫚酸四種標準品的混合樣品。實驗發(fā)現用正相硅膠柱分離，靈敏度低，分析時間長，而且雜峰干擾較多；用反相C18色譜柱，單甘脂和棕櫚酸保留時間較近，不能完全分離，這樣在制備時，棕櫚酸就會對單甘脂造成干擾，使收集的單甘脂不純；而使用氨基柱分離，單甘脂與其它色譜峰保留時間相隔都較遠，能有效的制備出純的單甘脂，色譜圖見圖1。

2.2.2 流動相對色譜分離的影響2.2.2.1冰乙酸的影響

冰乙酸對脂肪酸有較大影響，冰乙酸含量少會造成脂肪酸拖尾，同時靈敏度低，脂肪酸含量大，造成保留時間長，另外在蒸發(fā)光散射檢測器霧化時不易氣化，造成基線噪音增大，影響靈敏度，通過比較試驗，選擇0.1%（體積分數）的冰乙酸乙腈溶液作為流動相的A相，能得到較好的效果。

2.2.2.2 二氯甲烷的影響

當流動相中二氯甲烷的比例增加時，各色譜峰保留時間延長，各甘油酯和脂肪酸分離更好，但會降低脂肪酸的靈敏度，而且會使分析時間延長，當流動相中二氯甲烷的比例減少時，各色譜峰保留時間有所提前，但造成色譜峰重疊，不能很好分離，實驗對比了流動相中乙腈（含0.1%冰乙酸）：二氯甲烷比例分別為90∶10、70∶30、50∶50、40∶60、30∶70 時的分離效果，發(fā)現二者的比例為50∶50時，既能分離得較好，又能節(jié)省分析時間，也有較好的靈敏度，見圖1。

圖1 甘油酯和脂肪酸反相液相色譜分離譜圖Fig.1 The chromatographic peak of glyceride and fatty acid

2.2.3 蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度的確定

漂移管溫度對檢測器響應的影響隨溫度升高，流動相蒸發(fā)趨向完全而信噪比上升，但溫度過高，可能導致組分部分氣化而使信號變小，分別設定了50、60、70、80、90℃進行實驗，結果表明70℃時，信噪比最好，基線平穩(wěn)，能得到很好的效果。

2.3 胰脂酶用量的確定

在提取的乳脂中分別加入20、30、40 mg胰脂酶，進行水解后，按照已經確定的色譜條件注入液相色譜儀觀察水解效果，結果發(fā)現加入20、30 mg胰脂酶的樣品，單甘脂能和其他色譜峰完全分離，見圖2、3，加入40 mg胰脂酶的樣品，單甘脂的峰和后面的峰連在一起，不能分離，見圖4，這是由于加入的酶量大，水解出來的單甘脂和脂肪酸多，導致色譜峰變寬。為了得到最大的制備量和最好的分離效果，因此選擇胰脂酶的用量為30 mg。

2.4 單甘脂甲酯化方法的選擇

圖2 20 mg胰脂酶單甘脂分離色譜圖Fig.2 The chromatographic peak of monoglyceride（20 mg pancreatic lipase）

圖3 30 mg胰脂酶單甘脂分離色譜圖Fig.3 The chromatographic peak of monoglyceride（30 mg pancreatic lipase）

圖4 40 mg胰脂酶單甘脂分離色譜圖Fig.4 The chromatographic peak of monoglyceride（40 mg pancreatic lipase）

油脂的甲酯化方法有三氟化硼法、三甲基氫氧化硫法、酯交換法、乙酰氯法等。三氟化硼法、乙酰氯法和三甲基氫氧化硫法操作繁瑣，而且所用藥品三氟化硼、三甲基氫氧化硫甲醇和乙酰氯甲醇有毒，不利于人體健康，而酯交換法是加入氫氧化鉀溶液通過酯交換甲酯化，操作簡便易行、快速，省時省力，能得到理想的結果，因此選擇酯交換法作為單甘脂的甲酯化方法。氣相色譜分析脂肪酸甲酯色譜圖見圖5。

2.5 方法重現性試驗

取同一嬰兒配方奶粉，分別采用本研究所述方法對2-位脂肪酸進行6次測定，2-位棕櫚酸、油酸、亞油酸結果如表1。

從表1可以看出，測定結果重現性較好，RSD都在5%以下，三種脂肪酸中棕櫚酸的RSD最好，測定結果較為穩(wěn)定。

圖5 2-位脂肪酸氣相色譜分析譜圖Fig.5 The chromatographic peak of fatty acids in the 2-positions

表1 2-位脂肪酸重現性結果Table 1 The result of repeatability of fatty acids in the 2-position

2.6 與薄層法分離單甘脂數據對比

同一嬰兒配方乳粉，分別采用TLC和RP-HPLC法分離制備2-位單甘脂，甲酯化后注入氣相色譜分析2-位棕櫚酸含量，結果如表2。

表2 TLC法和RP-HPLC法數據對比Table 2 The comparison between TLC and RP-HPLC

從表2中數據可以看出，兩種方法測定結果是一致的，但RP-HPLC法操作更簡便、快捷，省時省力，所用設備先進、可靠，是現代分析技術的發(fā)展趨勢。

2.7 實驗室間數據對比

將4個奶粉樣品送到中國檢驗檢疫科學研究院綜合檢測中心檢測2-位棕櫚酸，同時在本實驗室用薄層和液相兩種方法制備單甘脂，檢測2-位棕櫚酸，結果如表3。從檢測結果可以看出，中國檢科院、本實驗室薄層法分離單甘脂和液相色譜法分離單甘脂三種方法檢測結果比較接近，用本方法檢測2-位脂肪酸是比較準確可靠的。

3 結論

本文建立了一種用反相高效色譜法分離2-位單甘脂，氣相色譜法分析2-位脂肪酸的嬰兒配方乳粉中2-位脂肪酸的測定方法，用本方法測定嬰兒配方乳粉中甘油三酯分子2-位脂肪酸含量，準確可靠，重現性好，2-位棕櫚酸RSD為1.99%，油酸RSD為3.22%，亞油酸RSD為4.37%。并且方法簡便、快捷，可以滿足日常檢測要求。

表3 2-位棕櫚酸占總棕櫚酸的比例Table 3 The proportion of 2-Position palmitic acid in total palmitic acid %

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