全自動SPE-HPLC法測定食品中丙酸鈣（鈉）和雙乙酸鈉

向文娟，王吉祥，馮雷，馬雪濤，珠娜

（云南省產品質量監督檢驗研究院國家熱帶農副產品質量監督檢驗中心，云南昆明650223）

丙酸鈣是世界衛生組織（WHO）和聯合國糧農組織（FAO）批準使用的安全可靠的食品與飼料用防霉劑；雙乙酸鈉是一種多功能的食用化學品，主要用作食品和飼料工業的防腐劑、防霉劑、螯合劑、調味劑、pH調節劑、肉制品保存劑，也是復合型防霉劑的主要原料。現代食品工業中，常常在面包和豆制品以及糕點中添加丙酸鈣（鈉）和雙乙酸鈉作為防腐劑，可以有效地抑制霉菌、黃曲霉毒素的生長，延長產品的保質期。但是過量的食用會導致腸胃燒傷[1]，造成中毒甚至死亡，對兒童、孕婦等特殊人群危害更大[2]。我國衛生部在GB 2760－2011《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》中規定丙酸鈣（鈉）可以在面包、糕點、醬油等食品中作為添加劑使用，最大使用量為2.5 g/kg，雙乙酸鈉的最大使用量是4.0 g/kg[3]。

在對食品中丙酸鈣（鈉）和雙乙酸鈉的檢測方法上，我國制定了國家標準，主要是蒸餾法和直接浸提法[4－5]，但蒸餾法由于檢測靈敏度和回收率都較低，樣品處理復雜，效率低，不易大批量的處理樣品；而采用直接浸提法大部分食品的水提取物成分復雜干擾嚴重，在色譜分析過程中造成基線抬升，靈敏度下降，且頻繁出現鬼峰，嚴重影響分析結果。采用固相萃取作為樣品前處理方法具有高效、穩定、準確定量、實現快速和自動化等優勢，可以有效降低復雜樣品中的基質干擾，提高樣品測定準確度和靈敏度[6－7]。本文通過研究，對不同固相萃取條件進行優化，建立Cleanert SAX強陰離子交換固相萃取的前處理方法，并采用Gilson公司的全自動固相萃取儀進行實驗，極大的提高工作效率和實驗的重現性，從而在利用高效液相色譜進行分析時有效降低基質干擾，提高檢測靈敏度，保證檢測結果的準確可靠。

1 材料與方法

1.1 儀器

島津高效液相色譜系統（HPLC儀）：低壓梯度泵（LC－20AT）、在線真空脫氣機（DGU－20A5）、紫外檢測器（SPD－20A）、自動進樣器（SIL－20A）、柱溫箱（CTO－20A）和島津液相色譜工作站（Lab solution）。Milli－Q 純水系統：美國M illipore公司；GX－274 ASPECTM吉爾森固相萃取儀：美國Gilson。

1.2 試劑與材料

磷酸氫二銨：AR級，中國成都化學試劑廠；丙酸鈣、雙乙酸鈉：德國SAFC公司；實驗室用超純水（18.2 MΩ）均來自Milli－Q純水系統；Cleanert SAX強陰離子交換固相萃取小柱：500 mg/6 mL美國Agela公司。

丙酸鈣（以丙酸計）、雙乙酸鈉（以雙乙酸鈉計）混合標準貯備液的配制（10.0 mg/mL）：準確稱取1.26g丙酸鈣（精確至0.000 1 g）于100 mL容量瓶中（相當于10.0 mg/mL丙酸），準確稱取1.00 g雙乙酸鈉（精確至0.000 1 g），用水溶解并定容至刻度。

流動相（1.5 g/L的磷酸氫二銨溶液）：稱取磷酸氫二銨1.5 g，加水溶解并定容至1 000 mL，用1 mol/L的磷酸溶液調節pH至3.0～3.5，過0.45 μm濾膜。

1.3 樣品前處理方法

稱取5.000 g（精確至0.001 g）的樣品至25 mL比色管中，用超純水定容至刻度，浸泡過夜（或超聲提取1 h）后，濾出液體，用5%的氨水調pH至堿性，待過吉爾森全自動固相萃取儀。

固相萃取條件：先將Cleanert SAX強陰離子交換柱依次用5 mL甲醇、水活化后，取上述樣品提取液1 mL，以2 mL純水淋洗，棄去淋洗液，用2 mL洗脫液進行洗脫并收集洗脫液，過0.45 μm濾膜，供HPLC分析。

1.4 色譜條件

色譜柱：Prevail Carbohydrate ES 5u（250 mm×4.6 mm id.）；柱溫：35 ℃；紫外檢測波長 214 nm；流動相：1.5 g/L 的磷酸氫二銨溶液（pH3.0～3.5）；流速：1.0 mL/min；進樣體積 5.0 μL。

1.5 標準曲線繪制

分別準確吸取 0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mL 的標準貯備液（1.2）于10 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，配制成濃度分別為 0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg/mL 的混合標準系列溶液。

2 結果與分析

2.1 固相萃取條件的優化結果

2.1.1 固相萃取柱的選擇

因丙酸鈣（鈉）及雙乙酸鈉在酸性溶液中解離為丙酸和乙酸，均為弱酸，因此分別使用Waters Oasis MAX混合離子固相萃取柱、Cleanert SAX強陰離子固相萃取柱和C18固相萃取柱對同一樣品中的丙酸和雙乙酸鈉回收率作比較，結果見表1。

表1 不同固相萃取小柱對樣品中丙酸和雙乙酸鈉回收率比較Table 1 The comparison of recoveries by different SPE column%

結果表明在相同條件下，Cleanert SAX固相萃取小柱的回收率最高，可達90%以上，說明強陰離子固相萃取柱對于弱酸性物質的凈化效果最好。

2.1.2 洗脫液的濃度與體積的確定

本實驗前期分別用同濃度的磷酸溶液和鹽酸溶液進行洗脫對比，發現鹽酸的洗脫效率明顯高于磷酸溶液。后分別用6%、8%、10%的鹽酸作為洗脫液，洗脫體積分別為1.0、2.0 mL時的回收率見表2。結果發現用2.0 mL 10%的鹽酸洗脫回收率最高，洗脫時，洗脫速度保留在1 mL/min。

表2 不同濃度洗脫液及洗脫體積的回收率比較Table 2 The comparison of recoveries of different elution liquid and elution volume

2.1.3 方法的精密度和檢出限

在空白樣品中添加丙酸及雙乙酸鈉標準物質，添加水平為2.0 g/kg，經Cleanert SAX固相萃取柱凈化，用2 mL 10%HCl洗脫過濾膜后經HPLC分析，做5個平行樣，記錄峰面積及保留時間。根據5次測定結果的峰面積計算出雙乙酸鈉和丙酸的含量，并計算相對標準偏差。結果見表3。保留時間的標準偏差為0.05%。以3倍的信噪比計算檢出限，最低檢出限濃度可達0.03 mg/kg。由表3可以看出，雙乙酸鈉含量相對標準偏差為1.47%，丙酸含量相對標準偏差為1.32%（n=5）。

表3 試樣測定的精密度及回收率實驗結果（n=5）Table 3 The resluts of precision and recoveries in detection of sample（n=5）

2.2 與國標直接浸提法的比較研究

將同一樣品經加標后，分別直接用水浸提和浸提后過Cleanert SAX固相萃取柱（以下稱過柱法），上液相色譜儀得出色譜圖，見圖1。其中虛線為直接浸提法得出的圖譜，實線為過柱法得出的圖譜。

由圖1可以看出，直接浸提法后的色譜峰出現鬼峰，且雜質干擾較多。而過柱后的色譜峰峰形較好，基質干擾較少。

2.3 與國標蒸餾法的比較研究

將同一樣品經加標后，分別用國標蒸餾法和浸提后過Cleanert SAX固相萃取柱的方法，得出溶液上液相色譜儀得出色譜圖，見圖2。其中虛線為國標蒸餾法得出的圖譜，實線為過柱法得出的圖譜。

圖2 過柱法與蒸餾法的比較色譜圖Fig.2 Chromatogram of compared with SPE and distillated

由圖2可以看出，蒸餾法得出的色譜圖較為干凈，雜質干擾也少，但是與過柱法比較，則回收率明顯較低，且檢出限較高，檢測結果不如過柱法的精確度高。

3 結論

本實驗應用Cleanert SAX固相萃取柱對食品樣品進行凈化處理后經HPLC測定食品中的丙酸鈣（鈉）和雙乙酸鈉，回收率在90%以上，最低檢出限可達0.03 mg/kg，相對標準偏差小于5%。而國標蒸餾法的回收率最高只能達到70%左右，丙酸鈣（鈉）的檢出限為0.03 g/kg，雙乙酸鈉的檢出限為0.015 g/kg，同時減少了國標蒸餾法中搭建蒸餾裝置繁瑣的程序，降低了實驗室使用明火的風險，提高了方法的回收率和靈敏度。利用Cleanert SAX強陰離子交換固相萃取柱，對丙酸和乙酸等弱酸有較好的凈化提取效果。有效地去除了國標法中直接浸提后雜質的干擾，加上利用Gilson全自動固相萃取儀，不僅方便，快捷，而且方法的精密度和準確度相對于國標法都大大提高，同時提高了方法的重現性和工作效率。

[1] 趙天華.化學試劑化學藥品手冊[M].2版.北京：化學工業出版社,2006：223

[2] 王娟,高秋菊,修麗華,等.離子色譜法對食品種丙酸鈣的測定[C].杭州:第十一屆全國色譜學術報告會論文集,2006:134-136

[3]中華人民共和國衛生部.GB 2760-2011食品安全國家標準 食品添加劑使用標準[S].北京:中國標準出版社,2011：7-8

[4]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.GB/T 23382-2009食品中丙酸鈉、丙酸鈣的測定高效液相色譜法[S].北京:中國標準出版社,2009:1-3

[5]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.GB/T 23383-2009食品中雙乙酸鈉的測定高效液相色譜法[S].北京:中國標準出版社,2009：1-3

[6] 張穎.生物樣品預處理技術及應用進展[J].天津藥學,2006,18(1):56-58

[7] 李小平,姚潯平,陳曉紅,等.有機酸檢測的固相萃取方法研究[J].中國衛生檢驗雜志,2007,19(8):115-118