瀘州地區龍眼核中總黃酮提取工藝研究

王俊，王芳，傅秀娟，彭藝飛

（瀘州醫學院藥學院，四川瀘州646000）

龍眼為無患子科（Sapindaceae）龍眼屬（Dimocarpus Lour.）常綠果樹，喬木。龍眼營養價值很高，也是重要的藥材之一，龍眼殼、龍眼核、龍眼花和龍眼皮、根均可以作為配伍的中藥[1]。龍眼核性味澀、平，氣微，味淡而微苦，具有止血、定痛、理氣化濕等功效，用于治療創傷出血、疝氣、疥癬、濕瘡等，并有開胃健脾，補虛益智的功效。桂圓肉可以治療虛勞贏弱，失眠健忘，驚悸怔忡以及脾虛泄瀉，產后水腫等癥[2]。龍眼核的重量占龍眼果實鮮重的1/3，由于沒有很好地綜合利用，大多作為廢棄物丟棄，造成了浪費和環境污染。在龍眼核中總黃酮的含量較高，研究發現黃酮類化合物對心腦血管損傷、肝損傷、心律失常等具有調節作用，同時還具有抗自由基和抗腫瘤活性[2]。為探討超聲波乙醇浸提法和乙醇回流法提取龍眼核總黃酮的實驗條件及效果，研究了各種因素對提取率的影響，同時通過正交法對龍眼核藥用成分的提取工藝進行了較全面的探索，確定了龍眼核總黃酮量超聲提取的最佳工藝[3－4]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要藥材

龍眼核：購于瀘州市場。

1.1.2 主要儀器

UV1700PC紫外可見分光光度計：上海鳳凰光學科儀有限公司；AS3120A超聲波清洗器、真空泵：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；HH－W三用恒溫水箱：江蘇省金壇市醫療儀器廠；架盤藥物天平BP－Ⅱ型：上海醫用激光儀器廠。

1.1.3 主要試劑

95%乙醇AR；亞硝酸鈉AR；硝酸鋁AR；氫氧化鈉AR；蘆丁對照品（批號：100080－200306，中國藥品生物制品檢定所）。

1.2 方法

1.2.1 龍眼核中總黃酮的提取

1.2.1.1 超聲提取

精密稱取9份5.000 g研細的龍眼核粉末，置于250 mL磨口錐形瓶內，按料液比加入一定濃度的乙醇，分別按L9（34）正交設計方法進行提取，抽濾，抽濾時用30%乙醇溶液少量頻繁的洗滌藥渣。將濾液用體積相近的容量瓶定容；并用紫外可見分光光度計測定其總黃酮的含量。正交試驗的因素和水平見表1。

表1 正交試驗的因素和水平Table 1 Factors and levels of orthoganal test

1.2.1.2 回流提取

精密稱取16份5.000 g研細的龍眼核粉末，置于250 mL圓底燒瓶。按料液比加入一定濃度乙醇溶液回流提取。將各組處理進行抽濾，將濾液用適當容量瓶分別定容；用紫外可見分光光度計測定其總黃酮的含量。并且通過單因素試驗考察不同因素對總黃酮含量的影響。

①不同回流時間對總黃酮含量的影響。固定料液比為 1∶11（W/V，下同），提取 3 次，選擇回流時間分別為 0.5、1、1.5、2、3 和 4 h 進行試驗，考察不同回流時間對總黃酮含量的影響。②不同料液比對總黃酮含量的影響。固定回流時間為3 h，回流提取3次，選擇料液比分別為 1∶7、1∶9、1∶11、1∶13 和 1∶15 進行試驗，考察不同料液比對總黃酮含量的影響。③不同回流次數對總黃酮含量的影響。固定料液比為1∶11，回流時間為3 h，選擇回流提取次數分別為1、2、3、4和5次進行試驗，考察不同回流次數對總黃酮含量的影響。

1.2.2 總黃酮的測定[5]

1.2.2.1 蘆丁標準曲線的繪制

精密稱取10 mg烘干至恒重的蘆丁對照品，用30%乙醇溶液溶解并定容至100 mL，得0.10 mg/mL的蘆丁對照液。分別精密吸取0.10 mg/mL的蘆丁對照液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于 10 mL 容量瓶中，分別加入10%亞硝酸鈉溶液0.50 mL，搖勻，靜置6 min；再加入10%硝酸鋁溶液0.50 mL，搖勻，靜置6 min；再加入4%氫氧化鈉溶液4.0 mL，用30%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，靜置12min，以30%乙醇作為空白液，于510 nm處測吸光度。吸光度測量結果見表2。以濃度對吸光度回歸，得回歸方程 A=12.272C+0.016 3；r=0.996 9，結果表明，濃度在0.05 mg/mL～0.49 mg/mL范圍內，濃度與吸光度線性關系良好。

表2 紫外可見分光光度法測定蘆丁對照液的吸光度Table 2 Determining the absorbance by using UV spectrophotometric method

1.2.2.2 樣品中總黃酮的測定

精密吸取樣品液0.50 mL于10 mL容量瓶中，按照1.2.2.1方法測其吸光度A，根據標準曲線計算總黃酮的含量。

1.2.3 超聲法和回流法最佳工藝的驗證試驗

分別選擇超聲法的最佳工藝即乙醇濃度60%，超聲3次，每次10 min，料液比1∶11；回流法的最佳工藝即回流3次，料液比 1∶11，回流3 h，平行3組進行驗證試驗，計算黃酮提取率。

2 結果與分析

2.1 正交試驗及驗證試驗

2.1.1 正交試驗

采用紫外分光光度法對9份樣品中總黃酮的含量進行測定，正交試驗及方差分析見表3、表4。

表3直觀分析結果表明，各因素對提取黃酮的影響程度大小為：料液比＞乙醇濃度＞超聲次數＞超聲時間。由表4方差分析結果可知：料液比和乙醇濃度對總黃酮提取率的影響達到了顯著水平，是提取總黃酮的主要影響因素。正交試驗中A2B3C2D1為最優水平組合，因此確定乙醇濃度60%，超聲次數3次，料液比1∶11，每次10 min作為總黃酮提取的最佳工藝。

表3 正交試驗結果Table 3 The results of the orthogonal experiment

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

2.1.2 驗證試驗

精密稱取3份5.000 g研細的龍眼核粉末，置于250 mL磨口錐形瓶內，按照上述優選提取工藝進行驗證，結果三批龍眼核總黃酮提取率穩定，平均提取率為2.795%，結果見表5。

表5 總黃酮提取驗證試驗Table 5 Demonstration test of the extraction of total flavonoids

2.2 回流法單因素試驗

2.2.1 回流時間對總黃酮提取率的影響

回流時間對總黃酮提取率的影響見圖1。

由圖1可知，隨著提取時間的增加龍眼核中黃酮的提取率逐漸增加，提取時間超過3 h后，總黃酮的提取率隨回流時間的增加增幅變緩，考慮到生產周期和設備的利用率，確定回流時間以3 h為宜。

2.2.2 料液比對總黃酮提取率的影響

料液比對總黃酮提取率的影響見圖2。

圖1 回流時間對總黃酮提取率的影響Fig.1 The effect of reflux time on the extraction rate of total flavonoids

圖2 料液比對總黃酮提取率的影響Fig.2 The effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids

由圖2可知，當料液比為1：11時，龍眼核中總黃酮的提取率最高，因此確定料液比為1∶11。

2.2.3 回流次數對總黃酮提取率的影響

回流次數對總黃酮提取率的影響見圖3。

圖3 回流次數對總黃酮提取率的影響Fig.3 The effect of reflux times on the extraction rate of total flavonoids

由圖3可知，當提取3次時，龍眼核中總黃酮的提取率最高，因此確定回流次數為3次。

2.3 超聲法和回流法最佳工藝的比較

超聲法和回流法的提取率見表6，由表6可知，采用超聲法提取龍眼核中總黃酮其平均提取率為2.795%，而采用回流提取法其平均提取率為2.394%，表明超聲提取更方便，有效，安全。故超聲法優于回流提取法。

表6 不同提取方法結果Table 6 The test results by different extraction methods

3 結論與討論

文中對比了回流法和超聲法在龍眼核總黃酮提取工藝中的差異，目的在于確定一種較優的提取工藝。

1）以蘆丁為對照品測定龍眼核中總黃酮的含量，加入鋁離子試劑，同時用氫氧化鈉溶液控制其pH，使黃酮化合物與鋁鹽形成絡合物，在510 nm處能獲得穩定的特征吸收峰。

2）提取液應趁熱抽濾，以防止乙醇揮發，在試驗中應用保鮮膜封住裝有乙醇的容器，所以操作應當仔細，減少誤差。

3）用回流法提取龍眼核中總黃酮，應選擇的是索式提取器，方便提取操作的順利進行。

4）通過兩種提取方法得到的結果來看，超聲法提取較回流法有更高的提取率。應用該法工藝設備簡單，操作方便，提取時間短，是一條較為理想的方法，最佳工藝為以11倍量的60%乙醇超聲提取3次，每次10 min，最佳提取率為2.795%。

[1] 蔡長河,唐小浪,張愛玉.龍眼果肉的食療價值及其開發應用前景[J].食品科學,2002(8):328-330

[2] 黃河勝,馬傳庚,陳志武.黃酮類化合物藥理作用研究進展[J].中國中藥雜志,2000(10):589-592

[3] 賢景春,陳美贏.超聲提取龍眼核總黃酮量的工藝[J].食品研究與開發,2010(4):5-7

[4] 陸海峰,趙進,李琳.超聲波提取龍眼葉總黃酮及其鑒別[J].微量元素與健康研究,2007(4):48-49

[5] 陳叢瑾,黃克瀛,李姣娟.植物中黃酮含量的光學測定方法研究進展[J].光譜實驗室,2007(4):524-530