乳桿菌H D 1.7肽類代謝產物的分離檢測

2014-05-07 10:58:24陳兵原韜黃微薇王艷梅

食品研究與開發 2014年7期

陳兵，原韜，黃微薇，王艷梅

（1.黑龍江工業學院環境工程系，黑龍江雞西158100；2.哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，黑龍江哈爾濱150001；3.黑龍江省科學院高技術研究所，黑龍江哈爾濱150001）

乳酸菌是一類將可發酵性糖轉化成乳酸的厭氧菌。日常生活中，人們經常腌制酸菜這種發酵性食品，主要就是依靠乳酸菌厭氧發酵的原理。在發酵基質酸菜水中含有多種乳酸菌的代謝產物，主要為肽類、多糖等。其中肽類物質經證實與Nisin[1]類似，具有一定的抑菌活性。

本課題研究結合梯度鹽析[2-3]的方法，通過減壓濃縮[4]、透析層析的技術手段從乳酸桿菌HD1.7[5]的酸菜水[6]中提純了這種肽類物質[7]，并深入研究其抑菌能力，與Nisin進行對照，同時檢測出其確切分子量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

測試菌：枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis，江蘇綠科生物技術有限公司；酸菜水，雞西豐源食品有限公司L-乳酸酸菜發酵液；胰蛋白酶 [0.15%（g/mL）]：美國GIBCO 公司；Marker（2 ku～36 ku）：紐英倫（NEB）生物技術有限公司；Nisin（1×106IU/g）：美國 Sigma公司。

測試菌培養基：準確稱取酵母膏3 g，蛋白胨8 g，蔗糖5 g，氯化鈉5 g，磷酸氫二鈉2 g，瓊脂10 g，加水至 1 000 mL，調節 pH6.8～7.0。

圖1 酸菜發酵液中肽類代謝產物的提取工藝Fig.1 Extraction technology of peptide metabolites from sauerkraut fermentation juice

ELITE 300垂直板電泳儀：美國WEALTEC公司；YC-3000噴霧冷凍干燥機：上海雅程儀器設備有限公司；Rotavapor R-210旋轉蒸發儀：瑞士BUCHI公司。

1.2 工藝流程

1.3 實驗設計

1.3.1 發酵液濃縮條件選擇

量取300 mL酸菜發酵液，在室溫下用離心機3 000 r/min～4 000 r/min離心處理30 min，棄除下層雜質和菌體泥狀混合物，保留上層清液，測量記錄上清液體積。然后用抽真空水浴式旋轉蒸發儀在系列溫度梯度下抽真空減壓式濃縮1 h，得到相應條件濃縮液。

溫度梯度：25、30、35、40、45、50、55 ℃。

將上述溫度梯度濃縮所得的濃縮液，分別稀釋至濃縮前上清液體積值，進行濾紙片抑菌試驗[8-9]，同時和濃縮前上清液進行對比，測定抑菌圈直徑。

以濃縮液黏稠性、抑菌能力為評價標準，選擇最佳濃縮條件。

1.3.2 濃縮液鹽析條件選擇

向上述抑菌效果較好的酸菜濃縮液中加入一定濃度的（NH4）2SO4溶液并攪拌，注意沉淀量的大小。首先選取質量濃度較低的（NH4）2SO4溶液進行鹽析[10]，觀察有無沉淀出現，逐漸增大（NH4）2SO4溶液質量濃度，觀察沉淀有無。

若有沉淀出現，將該濃度的（NH4）2SO4鹽析后的溶液攪拌均勻，分裝離心管進行離心，溫度4℃，轉速20 000 r/min，離心處理20 min。離心后取出離心管，以上清液和沉淀為測試物，用同濃度（NH4）2SO4做空白進行抑菌試驗，觀察抑菌圈大小。

混合上述離心管中的上清液，繼續增大（NH4）2SO4溶液質量濃度進行鹽析，當沉淀再次出現時，按照上述離心操作并進行抑菌試驗。

依此類推，直至不再出現沉淀為止。

鹽析濃度梯度：15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%。

以鹽析沉淀量多少、抑菌效果為評價標準，選擇最佳鹽析條件。

1.3.3 透析除硫酸銨鹽條件

已知Nisin的分子量為3 510 u，以透析袋的截留分子量乘以2＜目的蛋白分子量的原則為標準選擇透析袋進行透析除鹽[11]。收集梯度鹽析沉淀，加入0.01 mol/L Tris-H3PO4直至沉淀完全溶解，裝入透析袋截留分子量為1 500 u的透析袋在4℃下透析18 h～24 h，透析外液使用蒸餾水，5 h～6 h更換一次透析外液，直至向外液中滴入BaCl2溶液，不生成BaSO4為止。保留透析袋內物質進行層析分離試驗。

1.3.4 透析物分離純化

將100 g Sephadex G-25干膠顆粒懸浮于3倍量的蒸餾水中充分溶脹，進行凝膠活化[12]?；罨煤笱bSephadex G-25柱。采用HAc-NaAc緩沖溶液平衡層析柱，平衡后上樣分離，流速控制為1.0 mL/min，上樣量為5 mL，層析緩沖液使用pH=3.6的HAc-NaAc溶液30 mL，用0.02 mol/LKCl溶液90 mL作為洗脫液進行洗脫[12]。按1 mL/管定時接收，并數字標記層析接收管，試驗共標記96個接收管，在紫外280nm下進行吸光度值測定[13]。根據層析接收物質吸光值的不同，繪制層析接收液吸光值曲線，選擇吸光值較高部分進行收集。

1.3.5 分離純化液干燥條件

混合A280值較大的層析管內溶液，采用YC-3000噴霧冷凍干燥機在-15℃下進行噴霧干燥[14]，制備干粉樣品。

1.3.6 干粉性質測定

干粉對比Nisin進行抑菌能力測定。稱取10 mg干粉和10 mg Nisin，分別用0.01 mol/LTris-H3PO4溶解，并用蒸餾水稀釋至1 mg/mL。用0.01 mol/L Tris-H3PO4做空白進行濾紙片抑菌試驗，對比抑菌圈大小。

干粉具備蛋白質性質檢測。將10mg干粉用0.01mol/L Tris-H3PO4溶解，并用蒸餾水稀釋至1 mg/mL，用0.5%NaOH溶液調節pH至中性，加入1.5 mg/mL胰蛋白酶消化，并保溫1 h后，沸水浴3 min使胰蛋白酶滅活，然后進行抑菌試驗，用pH調至中性的干粉溶解液做空白。

干粉分子量大小測定。采用聚丙烯酰胺垂直板電泳[15]分析干粉的分子量大小，電泳點樣測試物為Nisin，干粉樣品3份（干粉1、2、3）及Marker。電泳后用蒸餾水沖洗膠片，將膠片浸入考馬斯亮藍R-250染色液，染色2 h～3 h，再用蒸餾水沖洗膠片，然后浸入脫色液脫色1次～2次，每次30 min。觀察脫色膠片上各譜帶位置，參照Marker確定樣品分子量。

2 結果與分析

2.1 發酵液最佳濃縮條件確定

原始300 mL酸菜發酵液離心處理后的上清液體積為248 mL。將發酵液溫度梯度濃縮，得到相應條件的濃縮液七種，樣品性狀見表1。

表1 不同溫度下濃縮液狀態比較Table 1 The comparison of oncentrated liquid state in different temperature

將25℃條件下的濃縮液稀釋后的樣品編號為1，30℃條件下的濃縮液稀釋后的樣品編號為2，以此類推，得到不同溫度下的濃縮液稀釋后的抑菌效果見表2。

表2 稀釋液抑菌直徑比較Table 2 The comparison of diluted liquid antibacterial diameter

通過表1和表2可以看出，酸菜發酵液可選擇利用在40℃條件下，濃縮比例為300 mL∶60 mL=5∶1，粘稠度適中的濃縮液，利于鹽析。同時在此溫度下濃縮，濃縮液的抑菌能力對比濃縮溫度為0℃的原始離心上清液也很明顯，而在相同濃縮時間條件下，其它溫度的濃縮液抑菌效果相對不理想。

2.2 鹽析條件選擇

酸菜水最佳條件濃縮液濃度梯度鹽析結果見表3。

表3 濃度梯度鹽析沉淀量對比Table 3 The comparison of concentration gradient salting precipitation

通過表3可知，向酸菜濃縮液中加入25%（NH4）2SO4溶液后出現沉淀，離心后測定上清液和沉淀的抑菌效果?；旌?5%（NH4）2SO4溶液鹽析后的離心上清液，增大鹽析濃度到50%時，沉淀再次出現，離心后上清液和沉淀的抑菌效果見表4。

表4 抑菌圈直徑測定結果Table 4 The results of determination of bacteriostatic band diameter

表3和表4結果表明，25%（NH4）2SO4鹽析上清液抑菌直徑明顯大于50%（NH4）2SO4鹽析上清液抑菌直徑，說明25%（NH4）2SO4鹽析后的清液中還存在沒有被沉淀下來的抑菌物質，需增大鹽濃度繼續鹽析。50%（NH4）2SO4鹽析沉淀抑菌直徑明顯大于 25%（NH4）2SO4鹽析沉淀抑菌直徑。說明用 50%（NH4）2SO4進行鹽析后，得到了存在于25%（NH4）2SO4鹽析上清液中的有效抑菌成分。50%（NH4）2SO4鹽析上清液抑菌直徑略大于此時空白試驗的抑菌直徑，說明經50%（NH4）2SO4鹽析后，上清液中絕大部分的抑菌成分已經被沉淀出來，很少部分的抑菌成分還保留在清液中，根據鹽析濃度，推測該少部分的抑菌物質可能是乳酸菌的次級代謝產物胞外多糖[16-17]，抑菌能力較弱。

2.3 透析物分離純化

收集25%和50%（NH4）2SO4梯度鹽析后的離心沉淀，經過透析層析后，在280 nm下，用紫外可見分光光度計分別測定1～96號接收管內液體的吸光值，并繪制吸光值曲線，結果見圖2。

圖2 層析接收液吸光值曲線Fig.2 The curve of chromatography for receiving fluid absorption value

數據顯示出現兩個峰值波動，第一次峰值附近（28～35號管），認為是酸菜水中的大分子抑菌成分，屬于快速洗脫組分，予以收集，其中31號管出現最大吸光值，A280=0.195。第二次峰值附近（62～82號管），認為是酸菜水中小分子抑菌成分，含量較多，屬于較慢洗脫組分，予以收集，其中70號管出現最大吸光值，A280=0.316。選擇收集28～35、62～82號層析管內液體組分，進行冷凍噴霧干燥處理制備凍干粉。

2.4 干粉性質測定

冷凍噴霧干燥所得干粉的抑菌能力測定結果見表5。干粉具備蛋白質性質檢測結果見表6。

表5 相同濃度下物質抑菌直徑比較Table 5 The comparison of bacteriostatic band diameter in same concentration

表6 胰蛋白酶處理前后中性干粉液抑菌直徑比較Table 6 The bacteriostatic diameter comparison of neutral powder liquid with trypsin added before and after

表6結果表明，pH調至中性的干粉液有明顯的抑菌效果，抑菌圈直徑d=1.52 cm。用胰蛋白酶處理后，抑菌圈直徑d=0 cm，干粉液抑菌活性消失，即該干粉抑菌物質可被蛋白酶分解，說明該物質具備蛋白質性質。

電泳膠片經脫色后可清晰看見Nisin、樣品干粉、Marker譜帶，具體結果見圖3。

圖3電泳照片表明Nisin分子量為3510 Da左右，干粉樣品分子量為3.5 ku和22 ku左右。顯示兩個分子量的值與吸光值測定試驗得到的兩個峰值的結果相吻合。

圖3 電泳膠片譜帶照片Fig.3 The photo of electrophoresis gel-film

3 結論

通過設計實驗從酸菜水中分離純化了乳酸桿菌HD1.7的肽類代謝產物。主要研究確定了原料在40℃下抽真空減壓濃縮5倍為最佳濃縮條件，在25%和50%兩個（NH4）2SO4鹽析濃度下可得到抑菌效果較好的有效成分。原料制備干粉后經抑菌檢測顯示其具備較強的抑菌能力，經胰蛋白酶檢測證實其可被蛋白酶分解，具有蛋白質性質，同時電泳試驗確定了其具體分子量組成，主要包括3.5 ku和22 ku兩部分，這與實驗在280 nm下測得的含有效成分層析液的A280=0.195和A280=0.316兩個吸光峰值相吻合。由于分子量較小，說明提純物質是小分子肽類。如果在鹽析層面上使用更高濃度的（NH4）2SO4進行，可能會得到新的沉淀，進而有可能更加標準化的確定該物質的分子量組成。實驗研究為乳酸菌肽類代謝產物繼續深入化研究提供了可靠的依據，相信隨著食品工業的發展，這種小肽類防腐劑將會具有更廣闊的應用前景，也必將創造出更大的效益。

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