銀杏葉中黃酮類物質的酶法提取研究

張偉，張煥新，施帥

（江蘇農牧科技職業學院，江蘇泰州225300）

銀杏葉，形似扇，又像飛蛾或鴨腳形，江蘇泰州是我國銀杏四大主要產區之一，素有“銀杏之鄉”的美譽，栽植銀杏近800萬株，占全國的三分之一。銀杏葉中含有160多種化學成分，其中黃酮類化合物、萜類內酯被認為是主要活性成分，銀杏酚酸為主要毒性成分[1]，黃酮類化合物具有極強的清除自由基能力和抗氧化能力，具有良好的防治心血管疾病的功效，因而受到國內外的廣泛研究[2-3]。銀杏葉中黃酮類物質主要包裹在細胞壁內（由β-D-葡糖以1，4-β-葡糖苷鍵連接），傳統方法大多不能完全破碎細胞壁，限制了黃酮類物質的溶出，嚴重影響了提取效率[4]。纖維素酶是一類復合酶，它能將組成細胞壁的纖維素骨架逐級降解成葡萄糖，進而破壞細胞壁骨架結構，增加細胞內活性成分的溶出[5]。因此，本文擬探索纖維素酶法提取銀杏葉總黃酮的最佳工藝，以期提高提取得率，并進一步探索銀杏葉提取物中黃酮類物質的種類。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

1.1.1 試驗材料

銀杏葉：大佛指品系，采自江蘇畜牧獸醫職業技術學院校內；HCl、乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、NaOH、H3PO4、氯化鐵、磷酸、高硫酸鉀均為分析純：中國醫藥集團上海化學試劑有限公司；甲醇（色譜純）：中國醫藥集團上海化學試劑有限公司；蘆丁標準品、槲皮素對照品、山奈酚對照品、異鼠李素對照品：中國藥品生物制品檢驗所；纖維素酶（酶活35 000 IU/g）：Sigma中國。

1.1.2 主要儀器設備

JH722可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；Fw 177型中草藥粉碎機：上海隆拓儀器設備有限公司；RE-52D旋轉蒸發器：上海青浦滬西儀器廠；Empower色譜工作站、Sunfire C18反相柱（4.6×150 mm，2.5 μm）、1525 μ 型二元泵、2996 紫外光檢測器：美國Waters公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取工藝

新鮮銀杏葉經過低溫烘干后，用中草藥粉碎機粉碎后過60目篩，準確稱取2.0 g，酶水解后滅酶，加入乙醇溶液浸提24 h，冷藏后過濾，計算銀杏葉總黃酮提取得率。

1.2.2 酶解工藝

以酶解溫度、酶處理pH、酶濃度和酶解時間為4個考察因素，以銀杏葉總黃酮提取得率為考察指標，進行L9（34）正交試驗設計，考察各因素對銀杏葉總黃酮提取得率的影響，以確定酶處理的最佳條件。正交試驗因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Parameters and test levels for orthogonal experiment

1.2.3 銀杏葉中黃酮類物質的測定方法

以蘆丁為標樣，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法[6-7]測定銀杏葉中黃酮類物質含量。標準曲線的回歸方程為：A=11.679C-0.00128，式中：C為蘆丁濃度，（mg/mL）；A為吸光度，相關系數R2=0.997 4，在濃度為0 mg/mL～0.056 mg/mL范圍內，有良好的線性關系。

式中：C為由標準曲線計算得出的樣品的總黃酮濃度，（mg/mL）；V為樣品溶液的體積，mL；N為樣品的稀釋倍數；M為銀杏干葉質量，mg。

1.2.4 銀杏葉提取物中黃酮種類的鑒定

移取銀杏葉提取物1 mL至50 mL的圓底燒瓶中，加入5 mL 25%的HCl溶液，在90℃水浴中回流加熱30 min。迅速冷卻，用甲醇定容至50 mL。用0.45 μm的微孔濾膜過濾。

色譜條件：選用反相柱進行洗脫。分析采用美國Waters公司1525μ型二元泵和2996型二極管陣列檢測器和Empower色譜工作站。

色譜柱為Waters公司的sunfire C18反相柱（4.6×150mm，2.5μm）。流動相為A∶B=50∶50（體積比，A為100%的甲醇，B為0.4%H3PO4水溶液），流速為1.0 mL/min，進樣量為 10 μL。

在線進行紫外檢測，200 nm～400 nm全掃描，分辨率1.2 nm。檢測波長為360 nm。

2 結果與討論

2.1 酶解工藝條件的確定

2.1.1 酶解溫度對銀杏葉總黃酮提取得率的影響

準確稱取2 g粉碎過篩的銀杏粉末放入50 mL容量瓶，加入20 mL HAc-NaAc緩沖溶液，調節pH為4，酶濃度為 0.3 mg/mL，調節酶解溫度為 30、35、40、45、50、55、60℃，酶解 2 h后滅酶，70%乙醇定容、提取、過濾，計算銀杏葉總黃酮提取得率，結果見圖1。

圖1 酶解溫度對總黃酮提取得率的影響Fig.1 Effect of temperature on flavonoids extraction yield

由圖1可知，隨著溫度的升高，銀杏葉總黃酮提取得率增大，在45℃時達到最大值，50℃保持在相似水平略有下降，隨后，隨著溫度升高，總黃酮提取得率顯著下降，當溫度達到55℃后，總黃酮提取得率隨溫度變化下降不明顯。這是由于纖維素酶在45℃～50℃之間有最大活力，同時也能保持較好的穩定性，如溫度進一步加大，由于蛋白質變性，酶的活性降低，浸提效果反而變差。

2.1.2 酶處理pH對銀杏葉總黃酮提取得率的影響

溶液的pH影響著酶的活性，纖維素酶的活性中心偏酸性條件[8]。故準確稱取2 g粉碎過篩的銀杏粉末放入50 mL容量瓶，加入20 mL HAc-NaAc緩沖溶液，調節酶解溫度為45℃，酶濃度為0.3 mg/mL，酶解2 h后滅酶，70%乙醇定容、提取、過濾，考察pH分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 時，銀杏葉總黃酮提取得率的變化，結果見圖2。

圖2 pH對總黃酮提取得率的影響Fig.2 Effect of pH on flavonoids extraction yield

由圖2可知，當pH 4.5時，總黃酮提取得率最高，且呈現向兩邊遞減的趨勢。由于pH既能影響酶的構象，也會影響底物的解離狀態，當pH4.5時，纖維素酶活力最大，可最大限度的破壞細胞壁纖維素β-1，4葡萄糖苷鍵，使傳質阻力減小，從而浸提效率最高[9]。

2.1.3 酶濃度對銀杏葉總黃酮提取得率的影響

準確稱取2 g粉碎過篩的銀杏粉末放入50 mL容量瓶，加入20 mL HAc-NaAc緩沖溶液，分別調節酶解溫度為45℃，酶解pH為4，調整酶濃度分別為0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4 mg/mL，酶解 2 h 后滅酶，70%乙醇定容、提取、過濾，分別計算銀杏葉總黃酮提取得率，結果見圖3。

圖3 酶濃度對總黃酮提取得率的影響Fig.3 Effect of enzyme consumption on flavonoids extraction yield

由圖3可知，酶濃度增大，總黃酮提取得率提高。但當酶濃度增大到0.25 mg/mL時，總黃酮提取得率幾乎不再提高，保持在相似水平并略有波動。

2.1.4 酶解時間對銀杏葉總黃酮提取得率的影響

準確稱取2 g粉碎過篩的銀杏粉末放入50 mL容量瓶，加入20 mL HAc-NaAc緩沖溶液，調整pH為4、酶濃度為0.3 mg/mL，保持溫度為45℃，分別酶解0.5、1、1.5、2、2.5、3 h 后滅酶，70%乙醇定容、提取、過濾，計算銀杏葉總黃酮提取得率，結果見圖4。

由圖4可知，隨著酶解時間的延長，銀杏葉總黃酮提取得率顯著增大，但當酶解時間達到2 h后，銀杏葉總黃酮提取得率增加不明顯，因為酶解產物的濃度增加，抑制了水解過程。

圖4 酶解時間對總黃酮提取得率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on flavonoids extraction yield

2.1.5 正交優化試驗結果與分析

在單因素實驗的基礎上，利用正交法“均衡分散”的特點[10]，以酶解溫度、酶處理pH、酶濃度、酶解時間為考察因素，以銀杏葉總黃酮提取得率為考察指標，進行正交設計，試驗結果見表2。

表2 L9（34）正交試驗結果Table 2Result of L9（34）orthgonal test

由表2可知，各因素對銀杏葉總黃酮提取得率的影響依次是：酶解溫度＞酶濃度＞酶解時間＞酶處理pH。

采用SPSS 13.0 for windows對正交試驗結果進行方差分析，結果見表3。

由表 3 可知，酶解溫度（p＜0.01）、酶濃度（p＜0.05）、酶解時間（p＜0.05）對銀杏葉總黃酮提取得率有顯著影響。酶處理pH對銀杏葉總黃酮提取得率影響很小，作為誤差項。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

根據銀杏葉總黃酮提取得率高的要求，本實驗確定最佳酶解條件為A2B1C3D2，即在酶解溫度為45℃、酶處理pH為4、酶濃度為0.3 mg/mL、酶解時間2 h時，銀杏葉總黃酮得率最高。根據最佳酶解條件，做3組驗證性試驗，同時做3組為未添加纖維素酶的空白試驗，結果見表4。

表4 酶法提取與空白試驗提取率比較Table 4 Comparison of extraction yield by cellulase and noncellulase

由表4可知，未添加纖維素酶的空白對照試驗，黃酮類物質提取平均得率為1.92%，而酶法提取試驗，黃酮類物質平均得率為2.80%，顯著提高了45.83%。對比試驗表明：纖維素酶在銀杏葉總黃酮提取過程中發揮了重要作用，隨著酶解進程的推進，纖維素酶不斷地將銀杏葉細胞壁裂解，促使包藏在細胞壁中的總黃酮不斷釋放出來，提高了總黃酮提取效率[11]。

2.2 銀杏葉提取物中黃酮種類的鑒定

銀杏葉提取物中黃酮類物質的HPLC檢測結果見圖5。

由圖5可以知，銀杏葉提取物中黃酮苷的3個峰與槲皮素，山奈酚，異鼠李素3個峰出峰時間一致，可以判斷為銀杏葉提取物中黃酮類物質成分主要是槲皮素，山奈酚，異鼠李素及其相對應的衍生物。

圖5 黃酮的高效液相分析圖譜Fig.5 The HPLC chromatogram of the flavonoid

3 結論

1）采用纖維素酶水解破壁，通過單因素試驗和正交試驗確定了纖維素酶水解破壁的最佳工藝為：酶解溫度為45℃、酶處理pH為4、酶用量為0.3 mg/mL、酶解時間為2 h時，在此條件下，銀杏葉總黃酮提取得率為2.80%，比空白對照組顯著提高了45.83%。

2）通過比較銀杏葉提取物和黃酮苷元對照品的高效液相圖譜得出，銀杏葉提取物中黃酮類物質主要是槲皮素、山奈酚和異鼠李素。

3）銀杏葉粗提物中除了含有黃酮類物質之外，還含有大量的銀杏內酯、銀杏多糖、優質蛋白質等活性物質，可進一步探索銀杏葉提取殘渣內銀杏內酯、銀杏多糖和蛋白質的提取利用，以增加銀杏葉的綜合利用度。

[1] 柳閩生,陳曄,徐常龍.銀杏葉有效成分的研究與資源的開發利用[J].江西林業科技,2006(2):28

[2] 李旭升,蔣磊,陳國榮,等.銀杏葉提取物對糖尿病大鼠巨噬細胞脂質過氧化作用和一氧化氮水平的影響[J].中華內分泌代謝雜志,2005,21(1):79-80

[3]姚碧文,陳偉.銀杏葉藥理研究進展[J].浙江中西醫結合雜志,2005,15(3):391-392

[4] 韓頌,徐穎,于喜水.纖維素酶在甘草提取工藝中的應用總結[J].中醫藥學報,2003,31(3):46

[5] V?ljam?e P.The kinetics of cellulose enzymatic hydrolysis:implications of the synergism between enzymes[D].The Sweden:Uppsala U-niversity,2002

[6] 鐘秋平,林美芳.黃皮果中總黃酮含量的測定及其黃酮種類的鑒別[J].食品科學,2007,28(8):411-414

[7] 董華強,寧正祥,崔志新,等.微波輔助提取多穗柯嫩葉黃酮工藝研究[J].農業工程學報,2007,23(2):213-217

[8] 王暉,劉佳佳.銀杏黃酮的酶法提取工藝研究[J].林產化工通訊,2004(38):14-16

[9] 吳梅林.銀杏葉中活性成分提取分離與測定研究[D].湖南:中南大學化學化工學院,2005

[10]李曉軍.超生波輔助提取金銀花黃酮類化合物的研究[D].陜西:陜西師范大學食品工程與營養科學學院,2009

[11]丁興紅,孫杰,喻治霞,等.纖維素酶輔助提取銀杏葉總黃酮的工藝條件[J].林業科技開發,2009,23(4):66-68