IBD毒株的卵黃培養(yǎng)方法研究

韓新會 （山東濱州沃華生物工程有限公司 256606）

IBD毒株的卵黃培養(yǎng)方法研究

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本研究表明，IBD毒株首次分離以雞胚絨毛尿囊膜(CAM)接種為首選，卵黃囊接種次之。本試驗(yàn)將經(jīng)CAM馴化的雞胚適應(yīng)毒轉(zhuǎn)卵黃囊(Yolk sac)馴化培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)果顯示卵黃囊接種的方法，CAM、胚體及尿囊液混合物中的病毒含量高于CAM接種方法的病毒含量，提示該接種方法可用于規(guī)模化培養(yǎng)。

IBDV毒株 卵黃培養(yǎng) 病毒含量 產(chǎn)量

雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)能在雞胚上生長增殖，Hitchner[1]證明9～11日齡雞胚絨毛尿囊膜(CAM)是分離病毒最敏感的接種途徑，感染的雞胚通常在3～5日內(nèi)出現(xiàn)死亡，雞胚CAM增厚或出現(xiàn)痘斑、腹部水腫、肝壞死、脾腫大及心臟魚肉樣病變。IBDV也可以適應(yīng)尿囊腔和卵黃囊(Yolk sac)接種。初次分離以CAM接種為首選，卵黃囊接種次之，尿囊腔接種為最差，感染的雞胚以CAM和肝含毒量最高，尿囊液最低[2]。實(shí)際生產(chǎn)中，盡管CAM的病毒含量比較高，但由于產(chǎn)量低并且接種CAM方法操作麻煩，不利于擴(kuò)大生產(chǎn)。因此，找到一種既方便操作又能提高產(chǎn)量的雞胚培養(yǎng)方式，是生產(chǎn)實(shí)踐中急需解決的問題。

通過臨床癥狀和病理剖檢結(jié)合實(shí)驗(yàn)室方法[3]確診并順利分離到一株IBDV野毒株，在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)感染死亡的雞胚胚體出血腫大，肝腫大壞死外，還發(fā)現(xiàn)卵黃囊也發(fā)生病變?nèi)绯鲅取Ｍㄟ^卵黃囊接種，收取死亡雞胚的CAM、胚體、尿囊液的混合物，然后與CAM進(jìn)行病毒含量的比較，試驗(yàn)表明該方法得到的IBDV病毒含量不低于CAM，而產(chǎn)量卻明顯提升，所以該方法有一定的可行性，值得推廣嘗試。

1 材料與方法

1.1 材料

雞傳染性法氏囊病野毒株，2008年分離鑒定[3]獲得；SPF雞胚(購自山東省無特定病原雞試驗(yàn)種雞場)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(黃石恒豐醫(yī)療器械有限公司)；旋渦混合器(太倉市科教器材廠)；DS-1組織搗碎機(jī)(江蘇金偉儀器廠)；生物安全柜(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 IBDV野毒株的培養(yǎng)及病毒含量測定 選擇11日齡發(fā)育正常SPF雞胚，在雞胚側(cè)壁打孔做人工氣室，將IBDV病料取出融化，4000r/min離心15min，取上清過濾，接種雞胚CAM，每枚0.2ml，共接種10枚，37℃培養(yǎng)。接種后24h、48h內(nèi)照胚1次/d，去掉死亡雞胚，以后照胚2次/d，連續(xù)觀察至120h，將死胚放4℃保存，詳細(xì)記錄雞胚死亡時間，最后集中無菌收取所有死亡雞胚的CAM，凍融3次后標(biāo)記C1代，置-20℃保存。將保存的C1代CAM凍融2次后，取出研碎，接種雞胚CAM進(jìn)行C2代的培養(yǎng)，最后收取死亡雞胚的CAM凍融保存。以同樣方式進(jìn)行C3、C4、……傳代培養(yǎng)。

將每代收獲CAM作10倍系列稀釋，取連續(xù)5個稀釋度接種雞胚CAM，每個稀釋度接種5枚雞胚，每枚接種0.2ml，37℃繼續(xù)培養(yǎng)，接種后連續(xù)照胚144h，棄去48h內(nèi)死亡雞胚，記錄48～144h內(nèi)死亡雞胚的數(shù)量，根據(jù)Eeed-Muench計算方法計算每代的半數(shù)致死量。

1.2.2 IBDV的卵黃囊接種培養(yǎng)及病毒含量測定 將經(jīng)CAM接種穩(wěn)定的IBDV接種7日齡發(fā)育正常SPF雞胚卵黃囊，每枚雞胚接種0.2ml，共接種10枚，每天照胚，連續(xù)觀察至接種后120h，收獲接種后48～120h內(nèi)死亡雞胚的CAM、胚體、卵黃以及尿囊液，記錄為Y1，置－20℃保存。將Y1凍融2次后取出，離心取上清接種雞胚卵黃囊，進(jìn)行Y2代培養(yǎng)，收獲死亡雞胚CAM、胚體、卵黃以及尿囊液，如此進(jìn)行Y2、Y3、……的傳代。依照1.2.1檢測方法進(jìn)行Y1、Y2、Y3……病毒含量的測定。

2 結(jié)果

2.1 IBDV雞胚CAM培養(yǎng)結(jié)果及病毒含量

CAM接種，雞胚死亡時間比較集中，主要集中在接種后72～96h之間，死亡雞胚的CAM增厚，有時可見痘斑；胚體較正常雞胚小，并且水腫出血；雞胚卵黃囊出血；剖檢雞胚可見肝臟腫大，有白色壞死灶；脾腫大，布滿白色壞死灶，整體紅白相間；肺充血於血，腎腫大出血、充血。病毒含量測定結(jié)果如表1：

表1 雞胚半數(shù)致死量(ELD50)測定結(jié)果

2.2 IBDV雞胚卵黃囊培養(yǎng)結(jié)果及病毒含量

將C4代作為雞胚卵黃囊接種的種毒接種雞胚卵黃囊，雞胚死亡時間集中在接種后60～96h，死亡雞胚胚體水腫出血，較正常雞胚小，卵黃囊出血，肝腫大出血。病毒含量測定結(jié)果如表2：

表2 雞胚半數(shù)致死量(ELD50)測定結(jié)果(枚)

2.3 不同接種方式病毒含量比較

從表中可以看出卵黃囊接種所收獲混合物病毒含量與CAM接種所收獲病毒含量區(qū)別不大，在同一代次下，二者并無統(tǒng)計學(xué)意義的差異，而僅收獲CAM的數(shù)量卻遠(yuǎn)低于收獲的卵黃囊、CAM、胚體與尿囊液混合物體積。

表3 病毒含量結(jié)果比較

3 討論

IBDV野毒株比較容易適應(yīng)雞胚CAM，成為雞胚適應(yīng)毒，在本實(shí)驗(yàn)中，IBDV野毒株在雞胚CAM培養(yǎng)至第四代達(dá)到了穩(wěn)定狀態(tài)，并且死亡時間集中，病變典型，證明該IBDV野毒株能夠很快適應(yīng)雞胚CAM培養(yǎng)。IBDV也比較容易適應(yīng)雞胚卵黃囊，而且卵黃中病毒含量較高，將此雞胚適應(yīng)毒由CAM接種轉(zhuǎn)化為卵黃囊接種，該毒能夠順利實(shí)現(xiàn)由CAM培養(yǎng)向卵黃囊培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化，并且能夠保持在穩(wěn)定狀態(tài)，同時得到的卵黃囊、CAM、胚體及尿囊液混合物病毒含量不低于雞胚CAM的病毒含量，張春杰等人[4、5]也曾證明經(jīng)卵黃囊接種馴化后的雞胚適應(yīng)毒，在卵黃囊內(nèi)可以達(dá)到較高的水平，由此將雞胚CAM接種方式轉(zhuǎn)為卵黃囊接種方式，更有利于擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模。另外，雞胚卵黃囊接種方式，使病毒的收獲量得到了很大的提高，同時由于雞胚接種日齡提前，減少了雞胚的培養(yǎng)時間，節(jié)約了生產(chǎn)成本，具有推廣優(yōu)勢。

IBDV的初次分離以CAM接種為首選，卵黃囊接種次之，說明雞胚卵黃囊接種培養(yǎng)不失為一種分離培養(yǎng)IBDV的方式，而且在本試驗(yàn)過程中證明卵黃囊接種的雞胚胚體、尿囊液以及CAM混合物病毒含量不低于CAM，進(jìn)一步說明采用雞胚卵黃囊培養(yǎng)具有一定生產(chǎn)實(shí)踐意義，但是IBDV雞胚培養(yǎng)收獲中卵黃容易液化混入尿囊液中，由于卵黃的成分復(fù)雜，對病毒的免疫原性以及制備疫苗是否有影響有待于作進(jìn)一步試驗(yàn)研究。

[1] Hitchner, S. B. 1970. Infectivity of infectious bursal disease virus for embryonating eggs[M]. Poult Sci 49: 611-613.

[2] 殷震, 劉景華. 動物病毒學(xué)[M]. 北京: 科學(xué)出版社，1997.

[3] 世界動物衛(wèi)生組織著. 農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局譯. 哺乳動物、禽、蜜蜂A和B類疾病診斷試驗(yàn)和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社, 2002: 606-615.

[4] 張春杰, 程相朝, 鄭祥海. 不同途徑擱雞胚培養(yǎng)傳染性法氏囊病病毒的比較研究[J]. 中國獸醫(yī)科技, 1996, 26(4): 25-27.

[5] 張春杰, 陳樹光, 鄭祥海. 雞傳染性法氏囊病毒雞胚適應(yīng)株的培育[J]. 河南畜牧獸醫(yī), 1998, 19(1): 24-26.

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