核受體LXRα在HBV陽性肝硬化及原發性肝癌組織中的表達及意義

鄭燕珊，倪仰鵬，陳理明，陸 軍，程 訸，徐 涵，牛永東，5

(1.汕頭大學醫學院藥理教研室，廣東 汕頭 515041；

2.揭陽市人民醫院病理科，廣東 汕頭 522000；

3.汕頭大學醫學院第一附屬醫院腫瘤科，廣東 汕頭 515041；

4.汕頭大學醫學院第一附屬醫院肝膽外科，廣東 汕頭 515041；

5.上海市腫瘤研究所“癌基因及相關基因國家重點實驗室”，上海 200032)

·論 著·

核受體LXRα在HBV陽性肝硬化及原發性肝癌組織中的表達及意義

鄭燕珊1，倪仰鵬2，陳理明3，陸 軍4，程 訸1，徐 涵1，牛永東1，5

(1.汕頭大學醫學院藥理教研室，廣東 汕頭 515041；

2.揭陽市人民醫院病理科，廣東 汕頭 522000；

3.汕頭大學醫學院第一附屬醫院腫瘤科，廣東 汕頭 515041；

4.汕頭大學醫學院第一附屬醫院肝膽外科，廣東 汕頭 515041；

5.上海市腫瘤研究所“癌基因及相關基因國家重點實驗室”，上海 200032)

目的 檢測肝臟X受體(Liver X receptor alpha，LXRα)在HBV陽性肝硬化組織及原發性肝癌中的表達情況及臨床意義。方法收集20例揭陽市人民醫院及汕頭大學醫學院第一附屬醫院手術切除的HBV陽性肝硬化原發性肝癌組織標本，應用免疫組化染色檢測LXRα表達。Huh7細胞中分別過表達小鼠mLXRα，及共過表達HBx(HBV X protein)和mLXRα，并檢測mLXRα及HBx對內源性LXRα信號通路下游靶基因SREBP-1 (Sterol regulatory element-binding protein 1)的影響；雙熒光素酶報告系統檢測人肝癌Huh7細胞中HBx對LXRα轉錄活性的影響。結果LXRα在肝硬化組織中陽性表達率為95%，高于癌組織的25%。HBx上調SREBP-1的表達可能與HBx調控LXRα的轉錄活性有關。結論HBx通過調節癌前高表達的LXRα的轉錄活性，并影響其信號通路可能與HCC發生相關。

LXRα；HBx；原發性肝細胞癌

原發性肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是我國及世界范圍內常見的消化系統惡性腫瘤，其確切的發病機制迄今尚不清楚[1-3]。病因學研究發現，HBV感染是我國HCC發生的首要危險因素[4-7]，其中HBx(HBV X protein)被認為是HBV感染者從慢性乙型肝炎到肝硬化，甚至HCC的整個漸變過程中的一個重要因子[5，8]。由于大多數HBV感染相關HCC患者都有脂代謝紊亂、肝硬化基礎。肝內高表達的肝X受體LXR α(Liver X receptor alpha，NR1H3)在膽固醇代謝平衡、脂肪合成中發揮著非常重要的調節作用。作為一經典的核受體，其功能發揮常需要輔因子(Co-factor)的協助來完成。HBx作為一功能廣泛的轉錄因子，與LXRα相互作用后參與HBV感染相關肝硬化、HCC發生的分子機制不清楚。

本研究通過觀察LXRα在肝硬化組織及對應的HCC組織中的表達；瞬時過表達小鼠mLXRα或/和HBx后觀察脂質代謝相關基因SREBP-1的改變及相關機制分析，探討相關HBV陽性肝硬化及原發性肝癌發生中的機制。

1 材料與方法

1.1 HCC組織標本、細胞系 20例HBV陽性肝硬化組織及原發性肝癌組織HCC的組織標本來自揭陽市人民醫院及汕頭大學醫學院第一附屬醫院的手術切除肝癌組織。所有病例均為術前未接受任何放化療的手術病例。肝癌細胞株Huh7細胞為本實驗室所保存。

1.2 質粒、報告基因系統、轉染 pcDNA空載體，pCDNA-Flag-HBx(AF100309.1)，pCMX-mLXRα，tk-LXRE-Luc，pCMXβ-gal及Luciferase assay系統及轉染方法參見我們的前期工作[9-10]。主要步驟如下：第1天，48孔板接種1×106個細胞；第2天，Lipofectamine?2000轉染。每孔轉0.6 μg DNA，3復孔；第3天，10 μM的GW3965處理(高糖MEM培養基含10%活性炭吸附處理的FBS)16～24 h，luciferase檢測(Vicor2 1420 multilabel counter)。LXR α激動劑GW3965購自Sigma。mLXRα或mLXRα和pCDNA-Flag-HBx共轉染肝癌細胞株Huh7細胞。Huh7細胞在含10%小牛血清的DMEM培養基中培養。培養條件：溫度37?C，濕度95%，CO2濃度5%。細胞長成單層后，37?C，0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化細胞，取4×105個細胞接種6孔板。待細胞滿度達70%時，參照Invitrogen公司的Lipofectamine?2000轉染試劑說明轉染Huh7細胞。隔天GW3965處理16～24 h，常規收集細胞及處理。

1.3 Real-time PCR 參照Invitrogen公司的TRIzol試劑盒說明提取細胞總RNA，Reverse Transcription System Kit(Promega)逆轉錄cDNA。以hCyclophilin為內參，Real-time PCR檢測LXRα與SREBP-1的水平。hCyclophilin上游引物：5'-TGGTGTTTGGCAAAGTGAAA-3'，下游引物：5'-TCGAGTTGTCCACAGTCAGC-3'；SREBP-1上游引物：5'-TGACTTCCCTGGCCTATTTG-3'，下游引物：5'-TTCAATGGAGTGGGTGCAG-3'；LXR α上游引物:5'-CCCTTCAGAACCCACAGAGATC-3'，下游引物:5'-GCTCCTTCCCCAGCATTTT-3’。

1.4 免疫組化 手術標本均用10%的中性福爾馬林固定，常規脫水、石蠟包埋及切片。免疫組織化學染色采用SABC法。鼠抗人LXRα(PP-K8607-00)抗體購自R&D，二抗購自購自北京中杉金橋生物技術有限公司。SABC試劑盒及DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物技術有限公司。磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗為陰性對照。雙盲法觀察切片，選取至少3個代表性視野，并根據顯色強度和陽性細胞百分率綜合判斷結果。

1.5 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件，Real-time PCR實驗和Luciferase assay報告基因結果用均數±標準差（±s)表示；組間差異比較用Excel的Student's-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LXRα在HBV陽性肝硬化組織及HCC中的表達 HBV陽性肝硬化組織中LXRα陽性表達率為95%(19/20)，明顯高于癌組織的表達率[25%(5/20)]。LXRα高表達的肝硬化組織中，其細胞定位除肝細胞的胞漿外，同時胞核內也可觀察到LXRα的表達(圖1A)；而弱表達的癌組織中，LXRα主要定位于肝細胞的胞漿(圖1B)；陰性對照(圖1C)中則未見棕黃色顆粒。

2.2 HBx與LXRα下游靶基因SREBP-1的關系 為研究異常表達的LXRα或LXRα信號通路參與了HBV感染相關的肝硬化或HCC的發生，我們在Huh7細胞中瞬時過表達mLXRα和/或HBx，結果發現HBx可以上調LXRα下游靶基因固醇調節元件結合蛋白SREBP-1的表達，尤其是在LXRα激動劑GW3965存在條件下。由于SREBP-1的功能主要與固醇代謝及甘油三酯合成有關，因此，我們推測LXR α信號通路的異常可能參與了HBV感染相關的肝硬化或HCC的脂代謝調控，見圖2。

2.3 HBx與LXRα轉錄活性的關系 為進一步研究LXRα信號通路與HBV感染相關疾病發生的可能機制，我們用LXRα的Luciferase assay報告基因系統發現，和pcDNA空載體相比，過表達的HBx可以上調內源性LXRα的轉錄活性；當我們共過表達小鼠mLXRα和HBx時，HBx對LXRα的轉錄激活效應尤其明顯，并且多呈配體依賴模式，見圖3。

圖1 LXRα免疫組化染色結果

圖2 過表達HBx與LXRα下游靶基因SREBP-1的關系

圖3 HBx與LXRα轉錄活性調控(*P＜0.05，**P＜0.01)

3 討論

肝細胞性肝癌由于其起病隱匿，病情發展快，轉移早，確診時多屬中、晚期，臨床治療及預后效果較差。因此，探討肝細胞癌的發生機制仍為目前肝癌研究領域所關注的重點。

HBx是HBV基因組里四個開放讀碼框中最小的一個，編碼一個154 aa的小分子蛋白質。由于HBx本身不是原癌基因的產物，只是一個轉錄調控多個HCC相關信號通路的輔因子(Co-factor)。因此，HBx被認為是HBV感染相關HCC的重要影響因素[4-7]。鑒于核或胞漿分布的HBx空間定位與核受體的轉錄激活相一致[11]；盡管已有韓國科學人員研究發現，HBx誘導肝細胞脂代謝通路紊亂及肝纖維化可能與LXR或PPAR(Peroxisome proliferator-activated receptor)核受體信號通路[12-14]、TNF-α通路及肝細胞凋亡[15]有關。但由于HBV的DNA聚合酶不具有校讀功能，使得包括HBx在內的HBV病毒蛋白存在多種型別和地域分布的不同；再加上不同種系的HBx轉基因小鼠中有的可以觀察到HCC發生[7-8]，有的則不可以觀察到HCC發生[5]。因此，我們選擇國內南方多流行的HBV B基因型及血清型Adw2作為我們的研究對象，不同于已有的韓國人的HBV C基因型及相應的血清型。

基于大多數HBV陽性原發性肝癌患者多存在嚴重的脂肪肝、肝硬化及纖維化，及大量的研究證明作為核受體超家族成員之一的LXRα及其下游基因SREBP-1信號通路與肝內甘油三酯、膽固醇代謝穩態平衡及紊亂密切相關等實際情況。我們首先對LXRα在HBV感染相關的肝硬化及HCC中的表達情況做了檢測。結果發現，LXRα在肝硬化組織中的表達明顯高于相對應的HCC組織。提示我們，LXRα或LXRα信號通路可能在HBV感染陽性HCC發生的早期，即脂肪肝、肝硬化及纖維化階段發揮作用。隨后，過表達HBx和/或mLXRα的實驗發現HBx可以上調LXRα信號通路下游SREBP-1的表達；機制分析進一步發現可能與HBx調控LXRα的轉錄活性有關。

鑒于“HBV感染-肝炎-慢性乙肝-肝硬化-HCC”發生發展的多階段、多步驟、多因素參與的復雜性，以及HBV病毒蛋白差異、LXRα、抑或HBx與LXRα間相互作用均存在作用范圍廣泛、機制復雜等因素，我們認為，“HBx-LXRα-SREBP-1”可能參與了國內HBV感染陽性HCC的早期發生，盡管上述機制尚需進一步深入研究。

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Expression and clinical significance of LXRα in HBV infection-associated liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma

ZHENG Yan-shan1,NI Yang-peng2,CHEN Li-ming3,LU Jun4,CHENG He1,XU Han1,NIU Yong-dong1,5
1.Department of Pharmacology,Medical College of Shantou University,Shantou 515041,Guangdong,CHINA;2. Department of Pathology,the People's Hospital of Jieyang,Shantou 522000,Guangdong,CHINA;3.Department of Oncology,the First Affiliated Hospital of Medical College,Shantou University,Shantou 515041,Guangdong,CHINA;4. Department of Hepatobilary Surgery,the First Affiliated Hospital of Medical College,Shantou University,Shantou 515041, Guangdong,CHINA;5.National Key Lab of Oncogene and Related Gene,Shanghai Cancer Institute,Shanghai 200032, CHINA

ObjectiveTo detect the expression of liver X receptor alpha(LXRα)in HBV infection associated liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma tissues and explore its clinical significance.MethodsThe expression of LXRα in 20 cases of HBV infection-associated liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma specimens from Jieyang People's Hospital and the First Affiliated Hospital of Medical College,Shantou University was detected by immunohistochemical staining.Endogenous SREBP-1,a typical LXRα target gene,was detected by real-time PCR after over-expressing mice mLXRα,HBx and mLXRα in Huh7 cells.The transcriptional regulation of LXRα signaling by HBx was evaluated by dual luciferase reporter system.ResultsThe positive expression rate of LXRα was 95%in cirrhosis,which was higher than that in HCC tissue with only 25%.The up-regulation of SREBP-1 expression by HBx may be related with the transcriptional activation of LXRα by HBx.ConclusionHBx maybe associated with the development of HCC by regulation of the transcriptional activation of LXRa,which was higher in cirrhosis,and activating the signal pathway

Liver X receptor alpha;Hepatitis B virus X protein;Hepatocellular carcinoma

R735.7

A

1003—6350(2014)15—2185—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.15.0851

2014-03-18)

中國博士后科學基金(編號：2012M510200)；廣東省自然科學基金(編號：S2012010010955)；上海市腫瘤研究所“癌基因及相關基因國家重點實驗室”開放課題(編號：90-14-03)；中央財政支持地方高校發展專項資金

牛永東。E-mail:ydniu@126.com