Clusterin在慶大霉素誘導(dǎo)的急性腎損傷大鼠模型中的表達(dá)及診斷意義

耿嘉男，孫 波，劉 凱，陳艷芳，劉 暢，雷冬艷，石 艷，于曉艷

（吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130021）

Clusterin在慶大霉素誘導(dǎo)的急性腎損傷大鼠模型中的表達(dá)及診斷意義

耿嘉男，孫 波，劉 凱，陳艷芳，劉 暢，雷冬艷，石 艷，于曉艷＊

（吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130021）

Clusterin是體內(nèi)一種異二聚體糖蛋白，最初見于公羊睪丸液，作用為促細(xì)胞聚集。其后陸續(xù)研究發(fā)現(xiàn)Clusterin參與許多重要生理過程：細(xì)胞周期調(diào)控、DNA的損傷修復(fù)和組織修復(fù)等，具有輔助生殖、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、抑制補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞免疫等功能［1］，還與調(diào)控細(xì)胞凋亡有關(guān)［2］。為進(jìn)一步明確尿中Clusterin水平與在急性腎損傷中的診斷意義［3，4］，本研究建立大鼠慶大霉素急性腎損傷模型，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)大鼠尿液中Clusterin的分泌水平，觀察其與腎臟病理形態(tài)學(xué)改變的關(guān)系，為將尿液Clusterin含量檢測(cè)應(yīng)用于無創(chuàng)性腎損傷診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

小鼠抗Clusterin單克隆抗體購(gòu)自R＆D公司，通用型二步法免疫組化試劑盒（PV－6000）和DAB顯色劑購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司，慶大霉素購(gòu)自Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及建立模型

40只雄性Wister大鼠（體重180－220g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，大鼠造模前禁食12h后皮下注射慶大霉素（GM）400mg·kg·d，連續(xù)注射2天，建立GM中毒性急性腎小管壞死（ATN）動(dòng)物模型，對(duì)照組大鼠皮下注射生理鹽水代替慶大霉素。大鼠置代謝籠每天收集尿液，共收集10天，置－80℃保存?zhèn)溆?；分別于第0d、1d、 3d、5d和第9d取模型大鼠腎臟備用。

1.3 ELISA檢測(cè)大鼠尿液Clusterin水平

大鼠尿液離心后取上清，尿樣按85μl包被液＋15μl樣品比例加入96孔酶標(biāo)板，4℃包被過夜；次日每孔加入150μl 1%BSA置37℃條件下封閉1h，洗板3次×3min，然后加入小鼠抗Clusterin單克隆抗體（1∶1000稀釋）100μl／孔，37℃孵育1h；洗板，加入羊抗小鼠二抗（1∶3 000稀釋）100μl／孔，孵育1h；采用鄰苯二胺－過氧化氫顯色系統(tǒng)進(jìn)行顯色，置37℃避光顯色10min后終止反應(yīng)，經(jīng)酶標(biāo)儀檢測(cè)A490值。

1.4 免疫組化檢測(cè)大鼠腎臟Clusterin表達(dá)

大鼠處死后取腎臟，于10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片；切片經(jīng)脫蠟、水化，微波熱修復(fù)，冷卻后經(jīng)3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化酶；Clusterin一抗以1∶100稀釋后加入，4℃孵育過夜，滴加二抗以及染色步驟嚴(yán)格按照PV－6000說明書操作。Clusterin蛋白陽(yáng)性染色見于胞質(zhì)，陽(yáng)性細(xì)胞染色程度按0－3分計(jì)算：0分，陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)＜10%；1分，陽(yáng)性表達(dá)占11%－25%；2分，陽(yáng)性表達(dá)占26%－50%；3分，陽(yáng)性表達(dá)≥50%［5］。染色后同時(shí)觀察腎小管間質(zhì)病理改變。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，組間比較采用方差分析，P＜0.05時(shí)視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠尿液中Clusterin表達(dá)

經(jīng)檢測(cè)大鼠造模第0d尿液即正常尿液Clusterin的A490值為0.56±0.25，造模后第1－2d尿液中Clusterin即有所增高（依次為0.64±0.21和0.72±0.30），但無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明大鼠造模后1－2d尿液中Clusterin即開始有所表達(dá)，自造模后第3－7d尿液中Clusterin均較正常尿液表達(dá)明顯升高（依次為0.82±0.31、0.94±0.29、0.94±0.31、0.94±0.28、0.87±0.36），造模后第8d尿液Clusterin含量有所下降（0.75±0.28），但仍維持在較高水平，造模后第9d尿液Clusterin含量下降近正常水平（0.56±0.22）。結(jié)果表明給大鼠予慶大霉素后1－2d尿液中Clusterin即開始出現(xiàn)，第3d開始含量明顯增加，第4－6d達(dá)到高峰，第7－8d開始Clusterin含量趨于下降，但仍高于正常水平，造模后第9d尿液Clusterin含量接近正常。

2.2 各組大鼠腎臟病理學(xué)檢查

細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)黃色顆粒即為Clusterin蛋白陽(yáng)性表達(dá)，免疫組化結(jié)果顯示：正常組大鼠腎臟無明顯病理改變，無明顯Clusterin蛋白表達(dá)，免疫組化評(píng)分為0分；造模成功后1d Clusterin偶有表達(dá)，評(píng)分為1分，病理可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；第3d、5d時(shí)Clusterin表達(dá)最多，評(píng)分為3分，腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，可見腎小管上皮細(xì)胞壞死、塌陷，腎間質(zhì)明顯增寬，間質(zhì)水腫明顯；第9d時(shí)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)有所減輕，Clusterin表達(dá)開始減少，評(píng)分為2分，見圖1。

圖1 正常組及模型組大鼠腎臟Clusterin表達(dá)（免疫組化，×200）

3 討論

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是可發(fā)生在各種臨床情況下的一種復(fù)雜的腎功能減退綜合征，2013年3月14第八個(gè)世界腎臟日就提出“關(guān)注AKI的防治”，有流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)表明20%的AKI由濫用藥物引發(fā)［6］，我國(guó)每年有近400萬人患上AKI，而人們對(duì)其認(rèn)知相對(duì)較少，若不及時(shí)發(fā)現(xiàn)并治療，極易發(fā)展為慢性腎臟疾病甚至終末期腎臟病（尿毒癥）導(dǎo)致死亡。傳統(tǒng)診斷AKI的指標(biāo)有血肌酐和尿素氮等，二者敏感性和特異性都不高，且不完全依賴于腎功能，與許多非腎性因素相關(guān)［7］，如受年齡、性別、種族、肌肉、營(yíng)養(yǎng)狀況、感染和分布容積等因素影響，血肌酐分泌水平有較大差異，尿素氮的產(chǎn)生和腎小管的處理、蛋白質(zhì)的攝入、代謝狀態(tài)、上消化道出血、血容量和大劑量使用激素的治療等密切相關(guān)。因此尋求具有高敏感性、特異性、易檢測(cè)的新的生物標(biāo)志物一直是AKI防治的研究熱點(diǎn)之一。

本實(shí)驗(yàn)采用皮下注射慶大霉素建立中毒性急性腎小管壞死（ATN）的AKI動(dòng)物模型，ELISA檢測(cè)模型大鼠尿液Clusterin含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AKI大鼠給予慶大霉素后1－2d尿液中Clusterin即開始出現(xiàn)，第3d開始含量明顯增加，第4－6d達(dá)到高峰，7－8d時(shí)仍維持較高水平。而免疫組化結(jié)果表明第3d、5d時(shí)腎臟Clusterin表達(dá)最多，間質(zhì)急性水腫病變最為明顯。說明尿液Clusterin含量與腎臟Clusterin含量及病變程度關(guān)聯(lián)性好，腎損傷早期尿液即有改變，而尿液檢測(cè)為無創(chuàng)性檢測(cè)，可避免不必要的腎組織活檢，提示可通過檢測(cè)病人尿液中是否有Clusterin分泌來預(yù)示AKI的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示尿液Clusterin含量可作為檢測(cè)早期AKI的新的生物標(biāo)志物，可應(yīng)用于臨床早期診斷和藥物研究中臨床試驗(yàn)的安全性監(jiān)測(cè)，不僅有利于防止腎毒性藥物的過量使用，也利于AKI臨床的早期診斷及改善預(yù)后。

［1］鄒穎剛，王 歡，耿嘉男，等.Clusterin在急性腎損傷診斷中的意義［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2013，17（5）：982.

［2］Prochnow H，Gollan R，Rohne P，et al.Non－Secreted Clusterin Isoforms Are Translated in Rare Amounts from Distinct Human mRNA Variants and Do Not Affect Bax－Mediated Apoptosis or the NF－κB Signaling Pathway［J］.PloS one，2013，8（9）：e75303.

［3］Murphy BF，Kirszbaum L，Walker ID，et al.SP－40，40，a newly identified normal human serum protein found in the SC56－9complex of complement and in the immune deposits in glomerulonephritis［J］.J Clin Invest，1988，81（6）：1858.

［4］Rosenberg M E，Dvergsten J，Correa－Rotter R.Clusterin：an enigmatic protein recruited by diverse stimuli［J］.J Lab Clin Med，1993，121（2）：205.

［5］吳 丹.腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化與移植腎纖維化的相關(guān)性［D］.吉林大學(xué)，2013.

［6］Crowley S T，Peixoto A J.Acute kidney injury in the intensive care unit［J］.Clinics in chest medicine，2009，30（1）：29.

［7］李一飛，姚廣濤.急性腎損傷中腎小管損傷標(biāo)志物的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，17（23）：279.

2013－11－20）

1007－4287（2014）07－1072－02

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目（科技支撐計(jì)劃20120962）；吉林大學(xué)開放性創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（2013B73337）；吉林省衛(wèi)生廳資助項(xiàng)目（2013Z101）

＊通訊作者