外源性表達VEGF165b對人膀胱癌裸鼠移植瘤生長影響的研究

張 金，尹 健，張斯棋，馮樹強，李然偉＊

（1.吉林大學第二醫院泌尿外科，吉林長春130041；2.吉林大學中日聯誼醫院血管外科，吉林長春130033；3.吉林大學中日聯誼醫院腎病內科，吉林長春130033）

外源性表達VEGF165b對人膀胱癌裸鼠移植瘤生長影響的研究

張 金1，尹 健2，張斯棋3，馮樹強1，李然偉1＊

（1.吉林大學第二醫院泌尿外科，吉林長春130041；2.吉林大學中日聯誼醫院血管外科，吉林長春130033；3.吉林大學中日聯誼醫院腎病內科，吉林長春130033）

目的 建立人膀胱癌T24細胞裸鼠移植瘤模型，探討外源性表達VEGF165b對其生長的影響及其機制。方法 分別移植未轉染和轉染VEGF165b表達載體的人膀胱癌T24細胞到裸鼠膀胱內，28d使處死動物，稱量腫瘤重量，測定腫瘤體積。Western blot法檢測腫瘤VEGF165b、p－VEGFR2、AKT、p－AKT蛋白表達。結果 轉染pcDNA－VEGF165b組腫瘤重量和體積與未轉染組和轉染pcDNA3.0組相比明顯降低（P＜0.05），而未轉染組和轉染pcDNA3.0組比較無統計學差異（P＞0.05）。Western blot結果顯示，轉染pcDNA－VEGF165b組與未轉染組和轉染pcDNA3.0組比較，VEGF165b表達增高，p－VEGFR2、p－AKT表達降低，而未轉染組和轉染pcDNA3.0組間無明顯差異。結論 外源性表達VEGF165b可通過抑制VEGFR2信號通路傳導而明顯抑制人膀胱癌裸鼠移植瘤生長。

膀胱癌；血管內皮生長因子165b；腫瘤侵襲

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1066）

血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是目前已知最重要的促血管生長因子。大量研究證實，在生理和病理條件下，VEGF基因和蛋白的表達與血管生成息息相關。因此研究證實血管生成和VEGF表達在膀胱移行細胞癌的發生、發展和復發過程中起重要作用［1］。VEGF由于mRNA剪接方式不同可形成多個變構體，其中最為重要的VEGF165可通過自分泌的方式刺激腫瘤細胞向惡性表型進展，而新發現的VEGF變構體VEGF165b可拮抗VEGF165，具有抗血管生成作用和抑制腫瘤功能［2］。本研究采用分子克隆與轉染技術，觀察外源性表達VEGF165b對荷瘤裸鼠人膀胱癌原位模型腫瘤生長的影響并探討其作用機制，為臨床膀胱癌綜合治療提供新的理論基礎和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 材料 BALB／cASlac－nu小鼠，6周齡，雌雄各45只，平均體重18g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司；人膀胱癌T24細胞，購自中國科學院上海細胞所。

1.2 方法

①VEGF165b表達載體構建：提取T24細胞總RNA。按照文獻設計引物克隆VEGF165b全長［3］，連接到pcDNA3.0表達載體中，進行測序鑒定，VEGF165b表達載體構建成功（簡稱pcDNAVEGF165b）。②細胞轉染：T24細胞生長融合率達90%，按照脂質體2000說明書分別將pcDNA3.0和pcDNA－VEGF165b表達載體轉染到T24細胞中。72h后用含G418（400μg／ml）培養液培養，每3－5d換液1次。10－14d獲得陽性細胞克隆，消化后種于96孔板中（1個細胞／孔），用含G418（200 μg／ml）培養液培養，獲得穩定轉染細胞。③細胞移植：按照我們之前文章報道方法［4］，麻醉小鼠，無菌條件下將HCl（0.1mol／L）100μl注入膀胱，后用KOH（0.1mol／L）100μl中和，磷酸鹽緩沖液沖洗。然后分別將未轉染、轉染pcDNA3.0和pcDNAVEGF165b表達載體的T24細胞（1.5×106個）注入膀胱，保留5h。④Western blot：收集細胞離心后加入500μl 4℃預冷的RIPA緩沖液（含有蛋白酶抑制劑）提取總蛋白，用Bioford法測定蛋白質濃度。總蛋白上樣40μg，聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉膜，PVDF膜取出后封閉，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1－2h，DAB顯色，膜拍照記錄；結果Tanon－1600figure gel成像系統成像。⑤統計學分析：所有數據采用SPSS 13.0統計分析軟件進行數據分析，計量資料實驗數據以均數±標準差（ˉx±s）表示。單變量配對資料之間的比較采用ANOVA法比較，以P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 外源性表達VEGF165b對人膀胱癌裸鼠移植瘤生長的影響 細胞移植后第28天時處死動物，未轉染組成瘤率為90.00%（27／30），轉染pcDNA3.0組成瘤率為93.33%（28／30），轉染pcDNAVEGF165b組成瘤率為90.00%（27／30）。取腫瘤稱重，測量并計算瘤體積。未轉染組和轉染pcDNA3.0組動物腫瘤重量為（1.8±0.4）g、（1.7± 0.3）g，體積為（1467±301）mm3、（1382±298）mm3，兩組瘤重和瘤體積比較無統計學差異（P＞0.05）；轉染pcDNA－VEGF165b組動物腫瘤重量為（1.0± 0.2）g，體積為（763±201）mm3，與未轉染組和轉染pcDNA3.0組相比明顯降低（P＜0.05），提示外源性表達VEGF165b對人膀胱癌裸鼠移植瘤生長有明顯抑制作用。

2.2 外源性表達VEGF165b對人膀胱癌裸鼠移植瘤VEGF165b、p－VEGFR2蛋白表達 Western blot結果顯示，未轉染組和轉染pcDNA3.0組腫瘤組織中VEGF165b低表達，p－VEGFR2高表達，兩組無明顯差異；而轉染pcDNA－VEGF165b組與未轉染組和轉染pcDNA3.0組比較，VEGF165b表達增高，p－VEGFR2表達降低（見圖1）。

圖1 Western blot分析VEGF165b蛋白表達水平

2.3 外源性表達VEGF165b對人膀胱癌裸鼠移植瘤AKT、p－AKT蛋白表達 Western blot結果顯示，未轉染組和轉染pcDNA3.0組腫瘤組織中p－AKT表達無明顯差異；而轉染pcDNA－VEGF165b組與未轉染組和轉染pcDNA3.0組比較，p－AKT表達明顯降低（見圖2）。

圖2 Western blot分析Akt、p－AKT蛋白表達水平

3 討論

在多種腫瘤中，VEGF的表達可作為獨立的患者存活和復發的預后指標。VEGF基因轉錄后，由于mRNA剪切形式不同形成促血管生成和抗血管生成的兩類亞型。在促血管生成亞型中，VEGF165和VEGF121發揮主要作用［5］。VEGFR蛋白在多種人類腫瘤包括膀胱癌、神經膠質瘤、肺癌、前列腺癌等中廣泛表達，并在腫瘤細胞遷移和侵襲中發揮關鍵作用［6］。VEGF165即是通過與VEGFR結合激活其下游信號傳導通路，刺激腫瘤細胞向惡性表型進展。VEGF165b作為腫瘤血管生成的抑制因子，可以拮抗VEGF165，與血管內皮生長因子受體（VEGFR）結合，導致下游信號傳導通路抑制［7］。到目前為止，還未有關于VEGF165b對于膀胱癌生長影響的體內研究報道，因此本文針對外源性表達VEGF165b對人膀胱癌T24細胞裸鼠移植瘤生長的影響進行了研究。

我們之前的研究結果表明采用細胞移植方法建立的人膀胱癌裸鼠原位模型與人類膀胱癌的發生過程和生物學行為類似，相較于非原位模型可更好地模擬膀胱癌的生物學行為，也更適用于新的抗癌治療效果的評價［4］。本實驗的結果表明，轉染pcDNA3.0組動物腫瘤重量和體積與未轉染組無明顯差異，但轉染pcDNA－VEGF165b表達載體的T24細胞移植組動物腫瘤重量和體積與前兩組相比明顯降低，提示外源性表達VEGF165b對人膀胱癌裸鼠移植瘤生長有明顯抑制作用。但三組動物腫瘤成瘤率沒有明顯差異。

VEGF165b主要通過拮抗VEGF165與血管內皮生長因子受體（VEGFR）結合，導致下游信號傳導通路抑制發揮腫瘤血管生成抑制作用［7］。因此，本研究檢測了VEGFR信號傳導通路相關蛋白的表達。結果顯示，轉染pcDNA3.0組動物腫瘤組織中VEGF165b、p－VEGFR2、p－AKT表達與未轉染組相比無明顯差異。而轉染pcDNA－VEGF165b表達載體的T24細胞移植組動物動物腫瘤組織中VEGF165b表達明顯增高，表明外源性表達VEGF165b成功；而p－VEGFR2表達降低，提示高表達VEGF165b可有效抑制VEGFR2活化；p－AKT表達降低，進一步說明VEGFR2信號通路被抑制。上述結果表明，VEGF165b拮抗VEGFR2信號通路的活化在外源性表達VEGF165b抑制人膀胱癌裸鼠移植瘤生長中發揮重要作用。

研究顯示VEGF165b在不同組織中的表達有所不同，膀胱組織中有VEGF165b的表達［7］。VEGF165b廣泛存在于多種腫瘤和組織中，也極可能參與了膀胱移行細胞癌發生發展的關鍵調控環節。綜上，我們的研究顯示外源性表達VEGF165b具有抑制人膀胱癌裸鼠移植瘤生長的作用，而其拮抗VEGFR2信號通路的活化是重要原因之一，因此，VEGF165b可成為膀胱癌抗腫瘤治療的新基因靶點。

［1］Henriquez－Hernandez LA，Navarro P，Luzardo OP，et al.Polymorphisms of glutathione S－transferase mu and theta，MDR1and VEGF genes as risk factors of bladder cancer：a case－control study［J］.Urol Oncol，2012，30（5）：660.

［2］Biselli－Chicote PM，Oliveira AR，Pavarino EC，et al.VEGF gene alternative splicing：pro－and anti－angiogenic isoforms in cancer［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2012，138（3）：363.

［3］Bates DO，Cui TG，Doughty JM，et al.VEGF165b，an inhibitory splice variant of vascular endothelial growth factor，is down－regulated in renal cell carcinoma［J］.Cancer Res，2002，62（14）：4123.

［4］Perrot－Applanat M，VEGF isoforms［J］.Cell Adh Migr，2012，6（6）：526.

［5］Sitohy B，Nagy JADvorak HF，Anti－VEGF／VEGFR therapy for cancer：reassessing the target［J］.Cancer Res，2012，72（8）：1909.

［6］Woolard J，Wang WY，Bevan HS，et al.VEGF165b，an inhibitory vascular endothelial growth factor splice variant：mechanism of action，in vivo effect on angiogenesis and endogenous protein expression［J］.Cancer Res，2004，64（21）：7822.

［7］Rennel E，Waine E，Guan H，et al.The endogenous anti－angiogenic VEGF isoform，VEGF165binhibits human tumour growth in mice［J］.Br J Cancer，2008，98（7）：1250.

Effects of Exogenous VEGF165b on Nude Mice Model of Bladder Cancer in Situ

ZHANG Jin1，YIN Jian2，ZHANG Si－qi3，et al.
（1.Department of Urinary Surgery，The Second Hospital，Jilin University，Changchun130041，China；2.Department of Vascular Surgery，China－Japan Union Hospital，Jilin University，Changchun130033，China；3.Department of nephrology，China－Japan Union Hospital，Jilin University，Changchun130033，China）

Objective Establish the transplantation tumor model of human bladder cancer T24cells in nude mice and explore the exogenous expression of VEGF165bon its growth and its mechanism.Methods Human bladder cancer T24cells were transplant into bladders of nude mice.The mice were killed in 28dafter transplantation.Western blot was used to confirm the protein expression of VEGF165b、p－VEGFR2、AKT、p－AKT.Results Compared with untreated group and pcDNA3.0group，the weight and volume of tumor tissue were decreased in pcDNA－VEGF165bgroup（P＜0.05）.But there was no significant difference between untreated group and pcDNA3.0group（P＞0.05）.The protein expressions indicate that compared with untreated group and pcDNA3.0group，VEGF165bwas increased；p－VEGFR2and p－AKT were decreased.But there was no significant difference between untreated group and pcDNA3.0 group.Conclusion Exogenous expression of VEGF165bsuppresses signaling pathway of VEGFR2and inhibits the growth of nude mice model of bladder cancer.

Bladder cancer；VEGF165b，tumor invasion

Q786

A

張金，男，吉林大學第二醫院泌尿外科研究生。

2013－11－15）

1007－4287（2014）07－1066－03

吉林省自然科學基金（200905139）

＊通訊作者