不同方法獲取的腫瘤細(xì)胞提取物對(duì)肺癌細(xì)胞殺傷作用的實(shí)驗(yàn)研究

趙 鑫，劉玉俠，常 穎，盧衛(wèi)平，王啟文，王 寶，段北野，王 斌＊

（1.吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林長(zhǎng)春130012；2.吉林省腫瘤防治研究所，吉林長(zhǎng)春130012）

不同方法獲取的腫瘤細(xì)胞提取物對(duì)肺癌細(xì)胞殺傷作用的實(shí)驗(yàn)研究

趙 鑫1，劉玉俠2，常 穎1，盧衛(wèi)平1，王啟文1，王 寶1，段北野2，王 斌1＊

（1.吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林長(zhǎng)春130012；2.吉林省腫瘤防治研究所，吉林長(zhǎng)春130012）

本實(shí)驗(yàn)從抗原提取方法入手，采用梯度鹽水法對(duì)加熱和未加熱的肺腺癌細(xì)胞SPC－A－1進(jìn)行腫瘤細(xì)胞提取物提取，以此作為抗原，比較不同方法提取的腫瘤抗原在體外與人外周血淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)后對(duì)肺腺癌細(xì)胞SPC－A－1的殺傷活性，探討腫瘤抗原的有效獲取方法以及不同濃度抗原對(duì)腫瘤細(xì)胞的體外殺傷效果，為腫瘤抗原的獲取和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株 SPC－A－1，購(gòu)自上海生物細(xì)胞研究所。

1.2 試劑 IMDM培養(yǎng)基，胎牛血清，購(gòu)自Hyclone公司；IL－2，購(gòu)自北京四環(huán)生物制藥有限公司；淋巴細(xì)胞分離液，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程醫(yī)學(xué)研究所；MTT，購(gòu)自Sigma公司。

1.3 梯度高滲鹽水法提取腫瘤細(xì)胞提取物

3次上清總和用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD280，OD260吸光度，計(jì)算蛋白含量蛋白含量（mg／ml）＝1.45OD280－0.74OD260＝0.432mg／ml。未水浴加熱的SPC－A－1細(xì)胞同上方法提取腫瘤細(xì)胞提取物，測(cè)蛋白濃度。

1.4 MTT法測(cè)定CTL活性

1.4.1 效應(yīng)細(xì)胞的制備 按照試劑說(shuō)明制備人外周血淋巴細(xì)胞懸液，調(diào)濃度為5×106／ml，加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，0.5ml／孔，細(xì)胞數(shù)為2.5×106個(gè)／孔，再加入提取的不同濃度的腫瘤細(xì)胞提取物，濃度分別為5μg／ml，10μg／ml，20μg／ml，40μg／ml，37℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)3天，即效應(yīng)細(xì)胞（E）。

1.4.2 靶細(xì)胞的制備 取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的SPC－A－1細(xì)胞，調(diào)濃度為1×106／ml，即為靶細(xì)胞（T）。加入24孔培養(yǎng)板相應(yīng)孔內(nèi)，50μl／孔，效靶比為50∶1。

1.4.3 MTT法檢測(cè)CTL活性 參照文獻(xiàn)［1］介紹的方法略加修改。效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞混合培養(yǎng)24h后加入MTT（5 mg／ml）100μl／孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h，收獲各孔細(xì)胞，離心，棄掉上清，加DMSO，1ml／管，室溫下用滴管反復(fù)吹打各管至結(jié)晶物全部溶解，加入96孔培養(yǎng)板內(nèi)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定OD492值。

1.4.4 CTL活性計(jì)算公式 CTL活性（%）＝［1－（ODE＋T－ODE）／ODT］×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS V16.0軟件，采用t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

不同方法處理的SPC－A－1細(xì)胞提取物對(duì)外周血淋巴細(xì)胞CTL活性的影響，見(jiàn)下表1。從表中可以看出，加熱提取的抗原在濃度為20μg／ml，40μg／ml，時(shí)，對(duì)CTL活性的提高有明顯作用（P＜0.01，與加IL－2組相比），而未加熱的抗原在濃度為40μg／ml時(shí)與加IL－2組比較有明顯差異。在同濃度抗原的比較中，加熱組較未加熱組的CTL活性高（P＜0.05，濃度為20μg／ml；P＜0.01，濃度為40μg／ml）。

表1 不同方法處理的SPC－A－1細(xì)胞提取物對(duì)外周血淋巴細(xì)胞CTL活性的影響（n＝6）

3 討論

T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在腫瘤免疫排斥過(guò)程中占有重要地位。如CD8＋CTL可識(shí)別，殺傷帶有腫瘤抗原的腫瘤細(xì)胞，CD4＋T細(xì)胞通過(guò)釋放細(xì)胞因子放大CTL反應(yīng)，但它們的活化都是腫瘤抗原刺激的結(jié)果。因而，腫瘤抗原提取方法的選擇顯得十分必要。在本實(shí)驗(yàn)中，我們選用了不同條件處理的腫瘤細(xì)胞經(jīng)過(guò)梯度高滲鹽水法提取腫瘤抗原，結(jié)果證明43℃熱處理后提取的抗原比未加熱處理的抗原在體外對(duì)人外周血CTL細(xì)胞活性的激活效果更好。

熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）是體內(nèi)一類重要的應(yīng)激蛋白［2］，在受到高溫或其它因素強(qiáng)烈刺激時(shí)即可產(chǎn)生。Li和Srivastava［3］研究證明，天然HSP可與胞漿內(nèi)數(shù)百種多肽結(jié)合，HSP與此內(nèi)源性抗原多肽形成復(fù)合物，即熱休克蛋白－抗原肽復(fù)合物（HSP－antigen peptide complex，HSPPC）。此HSP－PC能夠?qū)υ撃[瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異性殺傷作用，這種殺傷作用不是來(lái)自于HSP本身，而是來(lái)自于與HSP相結(jié)合的短肽。HSPs能與腫瘤特異性抗原組成HSP－多肽復(fù)合物，增強(qiáng)腫瘤抗原的穩(wěn)定性和免疫原性，激活單核－巨噬細(xì)胞系統(tǒng)、活化自然殺傷細(xì)胞（NK）等，引發(fā)固有免疫反應(yīng)，非特異性的殺傷腫瘤細(xì)胞；同時(shí)促使腫瘤抗原提呈，引發(fā)特異性免疫反應(yīng)，提高機(jī)體對(duì)腫瘤的體液免疫和細(xì)胞免疫的能力［4，5］。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)［6，7］，HSP能提高特異性CD8＋T淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞表面抗原的識(shí)別，通過(guò)MHC I類分子的遞呈作用殺傷腫瘤。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)肺癌細(xì)胞SPC－A－1進(jìn)行加熱處理提取腫瘤細(xì)胞提取物作為抗原，其中包含有熱休克蛋白－腫瘤抗原肽，所以對(duì)腫瘤的殺傷作用可能是熱休克蛋白－腫瘤抗原肽激發(fā)了外周血淋巴細(xì)胞活性，提高了對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。但其確切的殺傷機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

［1］司徒鎮(zhèn)強(qiáng)，吳軍正主編.細(xì)胞培養(yǎng)［M］.第1版.西安：世界圖書(shū)出版西安公司，1996：186－187.

［2］Tutar L，Tutar Y.Heat shock protein：an overview［J］.Curr Pharm Biotechnol，2010，11（2）：216.

［3］Li Z，Srivastava PK.Tumor rejection antigen Grp94is an ATPase：implication for protein folding and antigen presentation［J］.EMBO J，1993，12：3143.

［4］Dressel R，Elsner K，Quentin T，et al.Heat shock protein 70is able to prevent heat shock－induced resistance of target cells in CTL［J］.J Immunol，2000，164（5）：2362.

［5］Nishikawa M，Takemoto S，Takakura Y.Development of heat shock protein with controlled distribution properties and their application to vaccine delivery［J］.Yakugaku Zasshi，2007，127（2）：293.

［6］Udono H，Srivastava PK.Comparison of tumor－specific immunogenicities of stress－induced proteins gp96，hsp90and hssp70［J］.J Immunol，1994，152：5398.

［7］Blachere NE，Udonn H，Janetazkis，et al.Heat shock protein vaccines against cancer［J］.J Immunotheraphy，1993，14：352.

2013－08－16）

1007－4287（2014）07－1061－02

＊通訊作者