HRE和hTERT修飾條件復制型腺病毒攜帶Egr－1介導的Smac對人食管癌細胞Eca109周期和凋亡的影響

陳文慶，金新天，閆 松，劉 剛，王 巍

（吉林省腫瘤醫院，吉林長春130012）

HRE和hTERT修飾條件復制型腺病毒攜帶Egr－1介導的Smac對人食管癌細胞Eca109周期和凋亡的影響

陳文慶，金新天，閆 松，劉 剛，王 巍＊

（吉林省腫瘤醫院，吉林長春130012）

目的 探討以HRE和hTERT修飾條件復制型腺病毒攜帶Egr－1介導的Smac（CARd.pE－Smac）對人食管癌細胞Eca109周期和凋亡的影響。方法 利用氯化鈷進行化學乏氧，病毒感染滴度為5MOI［Multiplicity of infection（virus／cell）］感染人食管癌Eca109細胞24h，并進行2Gy照射，12h后分別利用Western blotting檢測Smac蛋白的表達，PI染色和AnnexinⅤ－FITC雙染，流式細胞術檢測細胞周期和細胞凋亡變化。實驗分為control、CARd.pESmac、hypoxia、2Gy、H＋CARd.pE－Smac、CARd.pE－Smac＋2Gy和H＋CARd.pE－Smac＋2Gy組。結果 CARd.pE－Smac感染常氧和乏氧的Eca109細胞后均未見Smac蛋白表達增加，而2Gy照射后，常氧、感染CARd.pE－Smac和乏氧再感染CARd.pE－Smac均能使Smac蛋白表達增加，尤其以三者聯用后Smac表達增加最大；感染CARd.pESmac未對細胞周期有明顯改變，而乏氧、2Gy和感染CARd.pE－Smac任二者（乏氧與2Gy除外）或者三者聯用均能顯著增加S期和G2／M期細胞百分比增加（P＜0.05，P＜0.01），尤其以三者聯用作用更強；而且，對于細胞凋亡的誘導作用與周期進程變化的規律相類似。結論 HRE和hTERT修飾條件復制型腺病毒攜帶Egr－1介導的Smac在人食管癌細胞Eca109中顯著過表達，且能夠導致細胞發生S期延遲和G2／M期阻滯，并誘導細胞發生凋亡。

缺氧反應元件；人端粒酶逆轉錄酶；條件復制型腺病毒；人食管癌

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1054）

食管癌是消化系統常見惡性腫瘤，我國是食管癌的高發地區，食管癌主要采用以手術為主，放化療為輔的治療方案，但由于個體差異導致患者產生放化療耐受，從而影響效果。腫瘤基因－放射治療提出將早期生長因子－1（early growth factor－1，Egr－1）啟動子置于治療基因的上游，從而增強輻射條件下治療基因的表達，提高效果［1，2］。但是，腫瘤基因放射治療中如何提高靶向性和選擇高效的靶基因非常重要。第2個線粒體衍生的胱天蛋白酶激活劑（second mitochondria－derived activator of caspase，Smac）是2000年Wang等［3，4］從HeLa細胞中分離出并的一種新型線粒體蛋白質，具有顯著的促凋亡活性，其過表達具有增強腫瘤細胞放射敏感性的功能，可以作為靶基因；另外，人端粒酶逆轉錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）啟動子具有腫瘤細胞內高表達的特點，而缺氧反應元件（Hypoxia response elements，HREs）具有乏氧誘導特性［5，6］，將HRE和hTERT串聯來修飾條件復制型腺病毒（conditionally replicative adenovirus，CRAd）對Smac的調控，有望實現靶基因在乏氧腫瘤細胞的高效表達，而且也充分結合Egr－1的輻射誘導特性，大大提高腫瘤基因－放射治療效果。基于此，本研究利用HRE和hTERT修飾條件復制型腺病毒攜帶Egr－1介導的Smac表達，觀察對食管癌細胞Eca109周期和凋亡的影響，以期為食管癌的基因－放射治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞系及培養

人食管癌細胞株Eca109購自中國科學院上海細胞生物學研究所，利用含10%胎牛血清、100U／ml青霉素和鏈霉素的PRMI1640培養基（均為Gibco產品，美國）培養，條件為37℃，5%CO2.

1.2 條件復制型腺病毒

HRE和hTERT修飾的條件復制型腺病毒Ad.Egr－1－Smac－HRE－hTERT－E1A－E1Bp－E1B55K（CARd.pE－Smac）由吉林大學衛生部放射生物學重點實驗室劉威武博士構建并惠贈［7］，由HRE和hTERT串聯修飾腺病毒載體的復制，而且還具有Egr－1介導Smac過表達的特性。

1.3 實驗分組、乏氧與照射

實驗分為control、CARd.pE－Smac、hypoxia（H）、2Gy、H＋CARd.pE－Smac、CARd.pE－Smac＋2Gy和H＋CARd.pE－Smac＋2Gy。人食管癌細胞Eca109采用化學乏氧劑氯化鈷（CoCl2，Sigma產品，美國）模擬缺氧狀態，終濃度為150μmol／L，乏氧時間為24h［7，8］。采用X射線深部治療機進行照射（Philips），照射條件為200kV電壓，10mA電流，濾板為0.5mm Cu和1.0mm Al，靶皮距離為50cm，劑量率為0.287Gy／min，總劑量為2Gy［7］。

1.4 Smac在人食管癌細胞Eca109中的表達

對數生長期的Eca109細胞按照1×106個／孔接種于6孔板，24h后待細胞穩定后給予終濃度為150μmol／L的CoCl2模擬乏氧狀態，24h后將病毒感染滴度5MOI［Multiplicity of infection（virus／cell）］CARd.pE－Smac感染細胞，24h給予2Gy照射12h后，按照《分子克隆技術》步驟提取各組細胞蛋白，分裝后凍存于－70℃冰箱中，備用。按照每條泳道50μg蛋白上樣后，進行SDS－PAGE電泳進行分離，轉膜后利用5%脫脂奶粉封閉1h，β－actin和Smac一抗4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗2次，利用辣根過氧化物酶標記的二抗在37℃條件下繼續孵育1h，發光，定影，拍照，分析。

1.5 細胞周期檢測

細胞分組及處理方式同1.4，按密度為3×105個／孔接種24孔板，細胞收集后PBS洗2次后棄上清，每個離心管中加入RNAse A 50μl，PI 200μl，混勻，室溫避光反應20min后上機檢測，每個樣品收取1.0×104個細胞。CellQuest軟件收集并分析數據，結果以細胞百分比表示。

1.6 細胞凋亡檢測

細胞分組及處理方式同1.5，細胞收取后采用Annexin V－FITC試劑盒檢測細胞凋亡變化。細胞PBS洗2次后棄上清，每個離心管中加入500μl緩沖液重懸細胞沉淀，加入5μl Annexin V－FITC和5 μl PI，混勻，室溫避光反應5－15min，2h內上機檢測，每個樣品收取1.0×104個細胞。CellQuest軟件收集并分析數據，結果以細胞百分比表示。

1.7 統計學處理

實驗數據以ˉx±s表示，利用SPSS17.0統計軟件one－way ANOVA檢驗進行分析，P＜0.05或P＜0.01表示具有統計學差異。

2 實驗結果

2.1 Smac蛋白的表達

由圖1可見，單純感染CARd.pE－Smac和乏氧不能誘導Eca109中Smac蛋白表達增加，而2Gy照射后可以使Smac表達增加，乏氧后再感染CARd.pE－Smac后也未見Smac表達增加，而感染CARd.pE－Smac后在給予2Gy照射，Smac蛋白表達顯著增加，特別是乏氧后感染CARd.pE－Smac后在給予2Gy照射，Smac表達增加最大。

Fig.1 Change of Smac protein expression in each groups by Western blotting

2.2 細胞周期的變化

由表1可見，單純感染CARd.pE－Smac后對Eca109細胞周期分布未見顯著改變，而乏氧，2Gy照射和乏氧后感染CARd.pE－Smac均導致S期和G2／M期細胞百分比較control組顯著增加（P＜0.05），感染CARd.pE－Smac后給予2Gy照射，S期和G2／M期細胞百分比較control組顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），且G2／M期細胞百分比較2Gy組也顯著增加（P＜0.05），乏氧后感染CARd.pESmac后給予2Gy照射，則S期和G2／M期細胞百分比較control和2Gy組均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。

Tab.1 Cell cycle of each phage in Eca109 cells（n＝3，ˉx±s，%）

2.3 細胞凋亡的變化

流式細胞術（圖2）結果顯示，乏氧、2Gy照射和乏氧后感染CARd.pE－Smac都能誘導Eca109細胞凋亡較control組顯著增加（P＜0.05），只是2Gy誘導的程度更大，其他二者基本一致；感染CARd. pE－Smac且2Gy照射和乏氧后感染CARd.pESmac并2Gy照射均能導致細胞凋亡較control組和2Gy組顯著增加（P＜0.05，P＜0.05），尤其以后者誘導程度更大（表2）。

Fig.2 The representative FCM picture of apoptosis with AnnexinⅤ－FITC／PI staining

Tab.2 Cell apoptotic percentage detected by FCM with AnnexinⅤ－FITC／PI staining［n＝4，ˉx±s，%］

3 討論

條件復制型腺病毒是比較理想的腫瘤基因治療中靶基因的表達載體，通常在腫瘤細胞中產生級聯的擴大效應［9，10］。而對其進行結構上的改造尤為關鍵，通常改變策略很多，針對腫瘤的乏氧環境這一特征，研究者考慮將HRE和hTERT改造到條件復制型腺病毒載體上，實現乏氧腫瘤細胞中病毒感染和復制的高效。另外，相關文獻證實［11，12］，電離輻射能夠介導Egr－1啟動下游基因的表達，但是Egr－1啟動子雖然具有誘導下游基因表達增加的特性，但是因為乏氧這一特性，導致效率較低。研究者考慮將乏氧和輻射雙重靶向應用到一個目標中，實現雙重效應。在本實驗中，筆者發現Smac蛋白表達結果顯示了HRE和hTERT修飾的條件復制型腺病毒攜帶Egr－1介導的Smac在人食管癌細胞Eca109表達增加，且以乏氧后感染該病毒并進行照射表達最大，實現了本實驗的初始目標，為下一步印證相關效應提供必要的基礎。

電離輻射后細胞如果處于G2／M期阻滯，這樣能夠保證DNA損傷得以修復，細胞得以存活，不至于死掉。細胞處于不同周期時，對輻射的敏感性不同，通常G2／M期是敏感期。本研究發現，感染病毒并未導致細胞出現明顯變化，藥物乏氧即可導致G2／M期細胞顯著增加（P＜0.05），可能與乏氧藥物的作用能夠有關，并不是乏氧環境導致的。而2Gy照射后也能導致G2／M期細胞顯著增加（P＜0.05），這與臨床放療的分割照射方案相似，可以使細胞集中在該期，有利于后續照射效果的提高。感染病毒并給予2Gy照射后G2／M期細胞顯著增加（P＜0.05），這說明Egr－1介導Smac蛋白發揮了作用。而乏氧的細胞施以相同的處理，則誘導G2／M期阻滯的程度更大。這對于基于此的食管癌放療方案是一個比較大的發現。

另外，Smac是凋亡誘導基因，電離輻射也能直接誘導細胞凋亡。以Smac為基礎的腫瘤基因－放射治療可以實現二者的相互協同作用。而且，輻射誘導細胞周期檢查點的阻滯，這是臨床腫瘤放射治療的基礎。本實驗結果表明，感染病毒未見凋亡誘導作用，乏氧和輻射都能誘導Eca109細胞凋亡增加，而且二者的共同作用效果更強，乏氧所發揮的作用也是和所用化學試劑模擬乏氧相關。對于常氧的細胞，感染病毒并2Gy照射則顯著增強凋亡誘導作用，且對乏氧的細胞施以相同處理，誘導能力更強。這說明本實驗的HRE和和hTERT修飾的條件復制型腺病毒介導輻射誘導Smac過表達對Eca109細胞具有乏氧狀態下輻射殺傷增強的作用，這對于食管癌的臨床放療具有重要意義。

綜上，本研究以HRE和hTERT來增加腺病毒在腫瘤細胞乏氧狀態下的高效復制，以Egr－1啟動子實現輻射時Smac的過表達增強，這樣的復合型表達載體能高效誘導Smac過表達；同時，該條件復制型腺病毒載體使細胞阻滯于G2／M期，并誘導細胞凋亡，實現對食管癌細胞的靶向殺傷增強，具有一定的科研價值和臨床治療參考意義。

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Effects on cell cycle and apoptosis of HRE and hTERT－modified replicative adenovirus carrying Smac mediated by Egr－1in human esophageal cancer Eca109 cells

CHEN Wen－qing，JIN Xin－tian，YAN Song，et al.
（Jilin Province Cancer Hospital，Changchun130012，China）

Objective To explored the effects on cell cycle and apoptosis of HRE and hTERT－modified replicative adenovirus carrying Smac mediated by Egr－1（CARd.pE－Smac）in human esophageal cancer Eca109cells.Methods Chemical hypoxia was achieved by CoCl2，human esophageal cancer Eca109cells were infected with CARd.pE－Smac by infection titer of 5MOI，after 24hcells were irradiated by 2Gy，then after 12h，cells were collected.Smac protein was measured by Western blotting，cell cycle change and apoptosis were measured by flow cytometry with PI staining and AnnexinⅤ－FITC double staining，respectively.All groups included control，CARd.pE－Smac，hypoxia，2Gy，H＋CARd.pE－Smac，CARd.pE－Smac＋2Gy and H＋CARd.pE－Smac＋2Gy.Results After hypoxic and normoxic cells were infected with CARd.pE－Smac，there were not obvious Smac expression increasing，but after 2Gy irradiation，Smac expression increased in cells of normaxia，CARd.pE－Smac infection and hypoxia＋CARd.pE－Smac infection，especially，Smac expression reached to maximum under three combination.Cell cycles had not obvious changes after CARd.pESmac infecting cells，but hypoxia，2Gy and CARd.pE－Smac infection，as the two（except hypoxia and 2Gy）or any three party，significantly increased S and G2／M cell percentages（P＜0.05，P＜0.01），especially，its role was most strong in combination with the three；in addition，apoptotic induction regularity was similar with cell cycle changes.Conclusion HRE and hTERT－modified replicative adenovirus carrying Smac mediated by Egr－1caused Smac obvious overexpression in human esophageal cancer Eca109cells，and leaded S phage delay and G2／M arrest，and also induced apoptosis.

Hypoxia response elements；hTERT；conditionally replicative adenovirus；Human esophageal carcinoma

Q78

A

2013－10－14）

1007－4287（2014）07－1054－04

吉林省自然科學基金資助（201115215）

＊通訊作者