組織型激肽釋放酶對大鼠急性腦缺血后GLUT－1表達的影響

韓雪梅，李妮妮，李 麗，田弘極，劉松巖＊，武利濤

（1.吉林大學中日聯誼醫院神經內一科，吉林長春130033；2.北京中醫藥大學東直門醫院）

組織型激肽釋放酶對大鼠急性腦缺血后GLUT－1表達的影響

韓雪梅1，李妮妮1，李 麗1，田弘極1，劉松巖1＊，武利濤2

（1.吉林大學中日聯誼醫院神經內一科，吉林長春130033；2.北京中醫藥大學東直門醫院）

激肽釋放酶－激肽系統（kallikre in－kinin system，KKS）在人體分布廣泛，發揮重要生理的作用，尤其在血管再生方面發揮重要作用［1］。本研究通過觀察組織型激肽釋放酶（TK）對腦缺血后GLUT－1蛋白表達的影響，并進一步探討TK作為腦保護劑對急性腦缺血的治療作用，從而為超過溶栓治療時間窗的腦梗死提供新的治療措施，為臨床腦血管病的防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與方法

選擇健康雄性的Wista大鼠30只，體重250－270g，鼠齡3－5個月，由長春市經濟技術開發區實驗動物中心提供。實驗動物隨機分為3組，每組10只。假手術組：只暴露，不插線阻塞大腦中動脈；鹽水組（NS組）：大腦中動脈持續永久缺血（PMCAO）后給予生理鹽水，劑量：2ml·kg－1·d－1。治療組（TK組）：大腦中動脈永久缺血并注射TK，劑量：17.5×10 3U·kg－1·d－1。給藥方法：在大鼠腦缺血后8h NS、TK腹腔注射給藥，連續3d。大鼠大腦中動脈永久性缺血模型參照Longa等［2］報道的方法。

1.2 免疫組化

CLUT－1為天津生物試劑公司產品。免疫組化染色采用SP法。試劑盒為福州邁新生物技術開發公司產品。

1.3 統計學分析

細胞計數，以單個標本為單位，選取腦內3個區域（缺血周邊區、中心區和對側大腦半球），每個區域選取3個200×鏡下視野，進行計數，取平均值，結果以x—±s表示，各組間比較用方差分析，所有統計學處理應用SPSS統計軟件。

2 結果

免疫組化顯示：正常對照組無GLUT－1蛋白陽性表達。NS對照組（PMCAO）GLUT－1表達增強。陽性細胞表現為細胞漿呈棕黃色。在皮層、底節的神經元及血管內皮細胞都有GLUT－1陽性表達。隨著缺血時間的延長，中心區表達逐漸下降，而周邊區陽性細胞數增多，表達呈逐漸上升趨勢，缺血3d，GLUT－1在缺血周邊區神經細胞的表達達高峰，同時中心區神經細胞接近正常水平，見圖1。TK治療組：GLUT－1在周邊區的神經細胞和血管內皮細胞的表達都顯著增強，與NS對照組相比差異顯著，P＜0.05，見表1、圖2。

在血管內皮細胞，隨缺血時間的延長，無論在缺血中心區還是周邊區，GLUT－1的表達均逐漸增強，陽性血管數增多，血管內皮細胞增生，缺血3d達高峰，見表2、圖3。

表1 TK對GLUT－1在缺血周邊區表達的影響（ˉx±s，n＝10）

表2 GLUT－1在血管內皮細胞的表達（n＝10，ˉx±s）

3 討論

腦缺血后的神經、血管調節機制尚不完全明確。多個研究表明激肽釋放酶（KKS）在腦缺血時促進神經功能的恢復。它能夠擴血管改善循環，促進血管新生，加強神經元及神經纖維的再生［3］，研究顯示KKS通過激肽受體降低血壓，神經保護［4，5］。倪耀輝等［6］研究激肽釋放酶在腦缺血后延遲給藥能增加缺血區NSE陽性細胞，從而證明其腦保護作用。血管再生在腦組織發生缺血后誘發。GLUT－1作為低氧誘導因子－1（HIF－1）的靶基因同樣可以通過促進血管生成、改善缺血區周圍的血流供應、改善腦內葡萄糖代謝從而促進腦組織重建。

本研究顯示：正常對照組無GLUT－1蛋白陽性表達，NS對照組（PMCAO）顯示GLUT－1表達增加，證明了缺血可以誘導GLUT－1的表達，至缺血后3d，周邊區的GLUT－1表達達高峰。TK組可見GLUT－1在周邊區表達上調，而且表達GLUT－1的神經細胞多為存活的神經元。表明TK能夠促進GLUT－1的表達。因此GLUT－1在腦缺血及TK治療后表達增加是神經元的代償性反應，有助于恢復腦的葡萄糖和氧代謝和穩定神經元細胞膜。

圖1 缺血3 d交界區GLUT－1（組化200×）

圖2 TK治療組3 d周邊區GLUT－1（組化200×）

圖3 TK治療后GLUT－1在血管內皮細胞高表達（組化200×）

GLUT－1在血管成分的表達同樣非常明顯。隨缺血時間的延長，無論在中心區還是周邊區，GLUT－1在血管內皮細胞中的表達逐漸增強，陽性血管數增多，伴有微血管增生。TK治療組GLUT－1在血管內皮表達顯著增強，與鹽水對照組相比P＜0.05。缺血后，局部血流量急劇減少，腦組織發生代償性反應，葡萄糖載體蛋白的數目增多，腦血流增加，使腦對糖的利用保持在正常水平［7］。同時GLUT－1重新分布在血管內皮細胞，血管腔內面的GLUT－1數量增多，使腦葡萄糖代謝維持，轉運增加［8，9］。GLUT－1在血管成分的高表達是機體對缺血缺氧后一種防御反應，能夠向缺血腦組織提供更多的葡萄糖，以維持腦的能量代謝［10］。

激肽釋放酶能夠促進多種血管生長因子及肝細胞性生長因子（HGF）的生成和釋放［11］。本實驗顯示：TK治療組缺血周邊區新生血管增多，GLUT－1在血管內皮細胞中表達數量及強度均增強，表明TK可以促進血管生成，并與通過上調GLUT－1的表達有關。

［1］Emam iN，Diam and isEP.Human tissue kallik reins：A road un－derconstrat ion［J］.Clin Chin Acta，2007，381（1）：78.

［2］Longa EZ，Weintein PR，Carson S，et al.Rerersible middle Cerebral aetery occlusion without crainietomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）：84.

［3］Xia CF，Yin H，Yao YY，et al.Kallikrein protects against ischemic stroke by inhibiting apoptosis and inflammation and promoting angiogenesis and neurogenesis［J］.Hum Gene Ther，2006，17：206.

［4］Xia CF，Yin H，Borlongan CV，et al.Kallikrein gene transfer protects afainst ischemic stroke by promoting glial cell migration and inhibiting apoptosis［J］.Hypertension，2004，43：452.

［5］Murakami H，Yayama K，Miao RQ，et al.Kallikrein gene delivery inhibits vascular smooth muscle cell growth and neointima formation in the rat artery after balloon angioplasty［J］.Hypertension，1999，34：164.

［6］倪耀輝，丁素菊.組織型激肽釋放酶對腦缺血大鼠神經和血管的影響［J］.中國神經精神疾病雜志，2009，35（3）：173.

［7］Nehlig A.Cerebral energy metabolism，glucose transport and blood flow：changes with maturation and adaptation tohypoglycaemia［J］.Diabetes Metab，1997，23（1）：18.

［8］Simpson IA，Appel NM，Hokari M，et al.Blood－brain barrier glucose transporter：effects of hypo－and hyperglycemia revisited［J］.J Neurochem，1999，72（1）：238.

［9］Dobrogowska DH，Vorbrodt AW.Quantitative immunocytochemical study of mouse brain［J］.J Histochem Cytochem，1999，47（8）：1021.

［10］Regina A，Morechoisne S，Borson ND，et al.Factors released by glucose deprived astrocytes enhance glucose transporter expression and activity in rat brain endothelia cells［J］.Biochim Biophys Acta，2001，1540（3）：233.

［11］Milkiewicz M，Ispanovic E，Doyle JL，et al.Regulators of angiogenesis and strategies for their therapeutic manipulation［J］.Int J Biochem Cell Biol，2006，38：333.

2013－10－16）

1007－4287（2014）07－1052－02

吉林省科技廳社會發展計劃項目（No.20090463）

＊通訊作者