運動對Fetuin—A誘導的胰島素抵抗鼠骨骼肌IR和IRS1磷酸化的影響

張明軍

摘 要：為了解運動對Fetuin-A誘導的胰島素抵抗鼠骨骼肌IR和IRS1磷酸化的影響。運用牛fetuin-A 注射建立胰島素抵抗鼠模型。將小鼠分為一次性運動組（Acute exercise group，AE）、8周運動組（Exercise group，E）、安靜對照組（Control group，C）。結果：與C組比較，AE組和E組胰島素抵抗指數均非常顯著下降（P<0.01）；AE組骨骼肌IRS1（Tyr612）磷酸化非常顯著增加（P<0.01）；E組骨骼肌IR（Tyr1150）磷酸化和IRS1（Tyr612）磷酸化均非常顯著增加（P<0.01）；AE組和E組骨骼肌GLUT4mRNA表達和骨骼肌葡萄糖攝取率均非常顯著增加（P<0.01）。結果說明：運動能夠非常顯著改善Fetuin-A誘導的胰島素抵抗，8周有氧運動機制與增加骨骼肌IR（Tyr1150）、IRS1（Tyr612）磷酸化和GLUT4 mRNA表達有關。急性運動與增加骨骼肌IRS1（Tyr612）磷酸化和GLUT4 mRNA表達有關。

關 鍵 詞：運動生物化學；Fetuin-A蛋白；胰島素抵抗；IR（Tyr1150）磷酸化；IRS1（Tyr612）磷酸化；小鼠

中圖分類號：G804.7 文獻標志碼：A 文章編號：1006-7116（2014）02-0141-04

Fetuin-A（又名a2-Heremans-Schmid糖蛋白，AHSG）是一種含量豐富的血清蛋白，主要由肝臟、胎盤合成，其作用廣泛，涉及胰島素抵抗的發生、血管鈣化、骨代謝和蛋白酶活性調節等[1-3]。Fetuin-A能夠抑制胰島素信號傳導，誘導胰島素抵抗產生[4-7]。血漿Fetuin-A水平與損害的葡萄糖耐受、胰島素抵抗、代謝綜合征、脂肪肝、動脈粥樣硬化和脂代謝紊亂密切相關[8-10]。運動減體重、藥物以及飲食干預均能夠通過降低成年人[11-13]、兒童[14]Fetuin-A水平，改善胰島素抵抗。

鑒于Fetuin-A通過抑制細胞胰島素受體的酪氨酸磷酸化，影響胰島素信號傳導，導致胰島素抵抗，并與全身性胰島素抵抗的發生關系密切，而運動和減體重能夠降低血清Fetuin-A水平，改善胰島素抵抗，推測其機制可能與運動調節Fetuin-A抑制的胰島素信號傳導過程有關，而胰島素信號傳導過程中的關鍵信號蛋白變化則可以解釋本機制，因此，為了在分子水平揭示運動改善Fetuin-A誘導的胰島素抵抗作用機制，本研究擬采用高生理劑量的Fetuin-A腹腔注射實驗鼠，建立Fetuin-A誘導的胰島素抵抗模型，研究胰島素抵抗的發生、骨骼肌胰島素信號傳導蛋白中胰島素受體（IR）、胰島素受體底物1（IRS1）和葡萄糖轉運的變化情況，以及運動干預后變化特征，嘗試揭示運動改善Fetuin-A誘導的胰島素抵抗機制。

1 材料與方法

1.1 材料

多克隆抗IR酪氨酸磷酸化抗體（tyrosine1150）、抗IRS1酪氨酸磷酸化抗體（IRS1 tyrosine612）以及胰島素放射免疫試劑盒（Biosource）、牛Fetuin-A（純度95%）購自廈門慧嘉生物公司。

1.2 方法

1）造模和動物分組及運動干預。

選用SPF級KM小鼠，8周齡，體重（44.52.3） g。胰島素抵抗模型制備：實驗鼠予純度為95%的牛Fetuin-A腹腔注射，每公斤體重劑量為 0.75 mg[1]。8 h后檢測血液和各項生化指標。以胰島素抵抗指數（HOMA-IR）判定Fetuin-A誘導的胰島素抵抗模型是否造模成功。胰島素抵抗指數（HOMA-IR）=空腹胰島素（IU·L-1）×空腹血糖（mmol·L-1）÷22.5。8 h后檢測HOMA-IR，Fetuin-A腹腔注射導致胰島素抵抗產生（Fetuin-A注射組（24.6±1.4）與對照組（11.1±1.6）比較，P<0.01）。對照組給予等量的生理鹽水。

造模成功的小鼠隨機分為安靜對照組（Control group，C）、一次性運動組（Acute exercise group，AE）和8周運動組（Exercise group，E）3組，每組6只。AE組和E組在跑臺上進行有氧運動干預，跑臺速度15 m/min，60 min/d，5 d/周，運動強度約為70%～75%最大攝氧量[15]。AE組進行1次運動；E組運動持續8周，同時執行牛Fetuin-A腹腔注射，1次/d。

2）試驗指標檢測。

（1）禁食12 h，運動結束后10%水合氯醛腹腔注射麻醉，心臟取血，斷頭處死后取腓腸肌組織備用。空腹血糖以京都血糖儀檢測。放射免疫法依照說明書檢測空腹胰島素。

（2）RT-PCR法檢測GLUT4mRNA：提取總RNA，檢測RNA純度和完整性，依照試劑盒說明書進行逆轉錄。內參β-actin上游引物：5-AGATAG ACGT GCAC AGGAAG-3，下游引物：5-GCTGGCGAACCGCCAG AGCT-3；GLUT4上游引物5-CGTGCGTGACATTAA AGAG-3，下游引物5-CTGGAAGGTGGACAGTGAG-3。PCR產物瓊脂糖凝膠電泳成像，凝膠成像分析系統分析，待測基因的相對表達量：待測基因用β-actin表示。

（3）胰島素（10 nmol/L）刺激腓腸肌經20 min后，液閃計數儀測定腓腸肌細胞葡萄糖攝取率（pmol/（mg·min））[17]。

（4）免疫共沉淀檢測蛋白磷酸化。各組細胞予胰島素刺激后，細胞裂解取上清。100 μg細胞溶解物SDS-PAGE蛋白分離、轉膜，予抗IR和IRS1抗體，加100 μL質量分數10% A-Sepharose沉淀，免疫沉淀復合物洗滌，上樣緩沖液煮沸、離心，取上清，電泳、轉膜、封閉過夜，分別加IR和IRS1抗磷酸酪氨酸抗體，洗膜，加辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗；曝光，洗滌后與ECL反應，光密度定量分析采用LeicaQ圖像分析儀（德國）。endprint

3）統計學處理。

各組實驗數據均采用均數±標準差表示，統計采用SPSS16.0統計軟件。各組的各變量進行單因素方差分析，LSD檢驗。顯著性水平和非常顯著性水平分別取P<0.05和P<0.01。

2 結果及分析

2.1 胰島素抵抗性和骨骼肌GLUT4mRNA表達

胰島素抵抗指數AE組（19.1±0.8）和E組（17.8±1.5）比C組（24.8±2.4）降低，差異具有非常顯著性意義（P<0.01）。骨骼肌GLUT4mRNA表達AE組（0.73±0.20）和E組（0.70±0.20）比C組（0.37±0.10）增加，差異具有非常顯著性意義（P<0.01）。

2.2 骨骼肌IR、IRS1磷酸化和葡萄糖攝取率

與C組相比，AE組IR（Tyr1150）磷酸化增加，差異沒有顯著性意義（P>0.05）；E組IR（Tyr1150）磷酸化增加，差異具有非常顯著意義（P<0.01）；AE組和E組IRS1（Tyr612）磷酸化增加，差異都具有非常顯著性意義（P<0.01）（見圖1）。

骨骼肌葡萄糖攝取率AE組（58.9±4.1）和E組（61.7±2.2）比C組（20.1±1.2）增加，差異具有非常顯著性意義（P<0.01）。

3 討論

為了研究運動影響Fetuin-A誘導的胰島素抵抗機制，必須制備Fetuin-A誘導的胰島素抵抗模型，從而排除其它致胰島素抵抗的因素干擾。參考Hennige A M[1]的研究，本研究采取牛Fetuin-A（純度95%，0.75 mg/g體重）腹腔注射的方法建立Fetuin-A誘導的胰島素抵抗模型，檢測模型鼠胰島素抵抗指數，比正常對照組顯著增加，Fetuin-A誘導的胰島素抵抗模型造模成功。

Fetuin-A在1944年被發現是血液中一種含量較豐富的糖蛋白，作用廣泛，主要由肝臟細胞合成并分泌到血液中[17]。最近有關Fetuin-A與肥胖、糖尿病、胰島素抵抗關系的研究成為了熱點。對3 710例調查對象的檢測顯示：獨立于性別、種族或心血管疾病因子，高血清Fetuin-A與老年人2型糖尿病的發病率密切相關，而且年齡超過75周歲，這種相關性的程度將更加顯著[18]。歐洲人癌癥和營養展望調查顯示，獨立于現有的其它相關風險因素，循環Fetuin-A將預示未來7年的2型糖尿病發病幾率[19]。針對健康、老年和體成分的研究也顯示：獨立于其它胰島素抵抗的風險因素，血清Fetuin-A 水平與隨后6年的Ⅱ型糖尿病發病幾率密切相關[8]。針對運動、飲食干預和手術減重的研究也發現了Fetuin-A變化與胰島素抵抗之間的關系。322名實驗者經過2年的飲食干預減重后，隨著體重減輕，血清Fetuin-A水平降低，胰島素抵抗、血脂和其它代謝指標也出現了良性改變[20]。而胃繞道手術后體重的減輕可以降低肥胖者血清Fetuin-A、胰島素抵抗，預計將使這些對象未來10年罹患糖尿病的幾率降低約70%[11，21]。針對胰島素信號蛋白的研究也部分揭示了Fetuin-A誘導胰島素抵抗機制，Fetuin-A與IR酪氨酸磷酸酶結合，抑制胰島素信號向下游的傳導，導致胰島素抵抗的產生[17]。重組Fetuin-A孵育的纖維母細胞中胰島素刺激的IR自磷酸化被抑制了80%，胰島素刺激的IR亞單位的酪氨酸磷酸化被抑制了40%，出現胰島素抵抗。

本研究中模型鼠在接受了Fetuin-A腹腔注射后，出現嚴重的胰島素抵抗，隨即分別給予一次急性運動和8周有氧運動干預，結果顯示：急性運動組和8周有氧運動組鼠的胰島素抵抗指數分別比安靜對照組非常顯著降低（P<0.01）。提示急性運動和8周有氧運動均能夠改善Fetuin-A誘導的胰島素抵抗，但是其中機制尚不清楚。進一步研究發現，與安靜對照組比較，急性運動組免疫共沉淀法檢測的骨骼肌IR（Tyr1150）磷酸化未發生顯著變化（P>0.05），IRS1（Tyr612）磷酸化則非常顯著增加（P<0.01）（見圖1）。而8周有氧運動組則呈現了與急性運動組不同的變化特征，與安靜對照組比較，運動組骨骼肌IR（Tyr1150）和IRS1（Tyr612）磷酸化均非常顯著增加（P<0.01）（見圖1）。作為胰島素信號傳導的效應，骨骼肌細胞內功能蛋白GLUT4承擔著葡萄糖轉運的功能，協助將葡萄糖攝取入細胞內，實現葡萄糖的跨膜轉運。本研究中，與安靜對照組比，急性運動組和8周有氧運動組RT-PCR法檢測的骨骼肌GLUT4mRNA表達和液閃儀測定的骨骼肌葡萄糖攝取率均呈現了相似的非常顯著增加趨勢（P<0.01）。

綜上所述，Fetuin-A對骨骼肌胰島素信號蛋白IR和IRS1均產生了抑制作用，誘導了胰島素抵抗的產生，研究結果與以往的研究結果一致。運動則能夠改善Fetuin-A胰島素抵抗，機制與運動解除了Fetuin-A 對IR和IRS1的抑制有關，但是急性運動和8周有氧運動的具體作用位點呈現差異，即急性運動僅僅能夠解除IRS1（Tyr612）磷酸化的抑制，而8周有氧運動則能夠解除IR（Tyr1150）和IRS1（Tyr612）磷酸化的雙重抑制。運動恢復了Fetuin-A影響的胰島素信號傳導功能，最終增加了骨骼肌GLUT4mRNA的表達，使得骨骼肌葡萄糖轉運和攝取功能增強，改善了胰島素抵抗。

本研究的不足之處在于僅僅分析了骨骼肌胰島素信號蛋白中IR和IRS1磷酸化變化情況，而Fetuin-A對胰島素抵抗的影響必然涉及大量信號蛋白和相關調節酶，因此本研究也必然存在較大的局限性，有待于在后續的研究中不斷補充和完善。

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