一株乳酸桿菌的選育

張開磊，王寶維

（青島農業大學優質水禽研究所，國家水禽產業技術體系營養與飼料功能研究室，山東 青島 266109）

乳酸菌是一類能從可發酵性碳水化合物中產生大量乳酸的革蘭氏陽性細菌的通稱，廣泛存在于人、畜、禽腸道、許多食品、物料及少數臨床樣品中[1]。因其獨特的生理學功能及對動物的益生作用，正日益引起人們的重視[2]。馬治宇研究證明，乳酸菌可以改善雛雞日增重和料肉比，王晶等研究證實，乳酸菌能提高肉仔雞的免疫力[3]。目前，微生物發酵飼料處于新興階段，選擇合適的發酵菌種，決定飼料品質的優劣。選擇發酵飼料的菌種生長速度和產酸量是試驗選擇的關鍵。本試驗對市售酸奶進行乳酸菌分離，并對分離菌株的生長速度、產酸性能及生化指標進行了檢測，為該乳酸菌進一步推廣應用提供一定的基礎依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

酸奶由本地超市購買，為內蒙古伊利公司生產的發酵乳。

1.2 試驗試劑及配制方法

MRS液體培養基（pH 6.8）：蛋白胨10 g，牛肉浸膏10 g，酵母提取物5 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1mL，檸檬酸氫二胺2 g，MnSO4·H2O 0.25 g，MnSO4· 7H2O 0.58 g，K2HSO42 g，蒸餾水 1 000 mL，加海水晶15 g，調pH后121℃滅菌20min。

0.9 %NaCl溶液：稱取NaCl0.9 g，溶于100mL水，121℃滅菌20min。

20%CaCO3乳濁液：稱取CaCO320 g加入到100mL蒸餾水中，制成CaCO3乳濁液。

革蘭氏染色法各種染液的配制：結晶紫染液，結晶紫2.0 g、草酸銨0.8 g、95%酒精20mL、蒸餾水80mL，先將結晶紫溶于酒精，草酸銨溶于蒸餾水中，然后將兩液混合，靜置48 h，此染液穩定，置密閉的棕色瓶中可儲存數月；革蘭氏碘液，碘1.0 g、碘化鉀2.0 g、蒸餾水300mL，先將碘與碘化鉀混合，加水少許，略加搖動，待碘完全溶解后再加蒸餾水至定量；脫色劑為95%酒精；復染劑為番紅（沙黃）染液，沙黃0.25g、95%乙醇10mL、蒸餾水適量，將沙黃溶解于95%乙醇中，待完全溶解再加蒸餾水至100mL。

1.3 菌種的分離純化

在超凈工作臺無菌條件下，將酸奶用無菌水稀釋，梯度為1∶10。取0.2mL涂布于改良MRS瓊脂上（培養基上加入CaCO3乳濁液1mL），30℃厭氧培養，直到出現CaCO3溶解圈的菌落，然后重復劃平板分離出單菌落。

1.4 分離株菌落形態特性及生化鑒定

挑取單菌落接種于MRS液體培養基，培養24 h后觀察菌株的菌體形態，然后進行革蘭氏染色，同時對菌株進行耐氧、產酸、試管凝集和固體發酵檢測試驗，并用乳酸菌生理生化微量發酵管進行生化鑒定。

1.5 乳酸菌生長曲線

根據費翅鯤等在MRS液體培養基中加入5%的菌液后，測定OD690nm值，每隔2 h取1次菌液檢測其OD690nm值，繪制乳酸菌生長曲線[4]。

1.6 乳酸菌酸度

酸度以吉爾涅爾度（oT）表示，即每100mL發酵液消耗1mL 0.1mol·L-1NaOH溶液記為1oT[5]。測定時，將0.1mol·L-1NaOH溶液裝入堿式滴定管中。用移液管分別吸取上述不同時間段的菌液2 mL于小燒杯中，將標定好的精密酸度計探頭插入燒杯中，使探頭與菌液充分接觸。然后一邊用氫氧化鈉滴定一邊注視酸度計讀數，以pH剛好為7時停止滴定，記下所用NaOH溶液的量，算出相應的吉爾涅爾度，繪制酸度變化曲線。

2 試驗結果

2.1 分離株形態鑒定

乳酸菌在MRS培養基上的菌落特征見圖1。

圖1 乳酸菌在MRS培養基上的菌落特征

由圖1可見，從樣品中共分離出20株能產生溶解圈的菌株，純化后在MRS培養基上形成表面光滑、邊緣整齊、中央隆起、易于刮起的直徑約1mm的奶油狀菌落。經過半固體瓊脂菌株的運動性檢穿刺試驗證明，菌株均生長于接種的穿刺線上，邊緣清晰，無擴散現象，表明均無運動性。

2.2 細菌形態觀察

顯微鏡下乳酸菌形態見圖2。

圖2 顯微鏡下乳酸菌形態

將分離菌株進行革蘭氏染色，油鏡下可見兩端平直的革蘭氏陽性桿菌，單個或呈短鏈排列。

2.3 乳酸菌液體培養結果

接種細菌試管與對照試管的比較見圖3。

由圖3可見，本試驗中接種細菌的試管變渾濁，對照試管澄清，由此可知，接種細菌的試管內為乳酸菌，無雜菌污染。

圖3 接種細菌試管與對照試管的比較

2.4 分離株生理生化鑒定

分離株生理生化特性見附表。

附表 分離株生理生化特性

該分離株無鞭毛、無芽孢、革蘭氏染色呈陽性，在30℃厭氧條件下培養48 h能長出乳白色扁圓形凸狀菌落。將該分離株接種到脫脂乳試管后，置于42℃恒溫培養箱中培養24 h，脫脂乳凝固但無氣泡產生，測定pH呈酸性。將該分離株乳酸發酵后，產物經硫酸和高錳酸鉀處理，可使含氨硝酸銀濾紙條變黑。對分離菌株進行微量生化反應管鑒定[6]。結果顯示，該菌株對葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、纖維二糖、甘露醇、山梨醇、七葉苷和水楊苷反應呈陽性，對精氨酸雙水解酶、明膠液化和還原性硝酸鹽反應呈陰性。上述特征表明，該株分離菌為乳酸菌屬[7]。

2.5 乳酸菌生長曲線測定結果

乳酸菌生長曲線見圖4。

由圖4可知，當加入5%的菌液后，測定OD690nm值為0.436，前18 h乳酸菌繁殖迅速，OD690nm值持續上升，乳酸菌濃度逐漸增大，20～36 h時菌體密度基本一致，乳酸菌處于生長穩定期。

2.6 乳酸菌酸度測定結果

乳酸菌產酸量的測定見圖5。

圖5 乳酸菌產酸量的測定

由圖5可知，從接種到20 h，培養液中的pH持續下降，說明此刻乳酸菌處于生長對數期，持續產酸；20 h后穩定約為3.64，此刻乳酸菌處于生長穩定期，產酸量降低。這與圖4生長曲線一致。

3 討 論

自20世紀80年代以來，隨著我國養殖業連續20多年以年均增率＞9%的高速度增長，畜牧生產區的飼料資源短缺問題也將越來越嚴重[8]。因此，積極開發新的飼料資源，提高現有飼料利用率已迫在眉睫。微生物發酵飼料可改善飼料的營養價值，提高動物生產性能，從而提高飼料利用效率。王春林等研究證明，發酵飼料可顯著提高豬的生產性能和屠宰性能[9]。選擇合適的發酵菌種是微生物發酵飼料成功關鍵。菌種本身不能產生有毒物質，符合安全性的原則；并且菌體本身具有很好的生長代謝活力，能有效地降解大分子物質和抗營養因子，合成小肽和有機酸等有益物質[10]。

研究表明，乳酸菌具有改善腸道功能、提高機體免疫力、改善機體營養狀況等作用[11]。其中改善營養狀況、提高免疫等作用已在食品、醫藥方面廣泛應用。乳酸菌在畜牧業中應用，可提供營養物質，改善消化道微生態環境，調節消化道免疫系統[12]。大量研究證明，乳酸菌對人和動物體保健和治療都有較好療效。張驍勇在育成梅花鹿飼糧中添加未調酸的乳酸菌添加劑，結果表明，添加未調酸的乳酸菌添加劑10 g·d-1·頭-1，能提高梅花鹿采食量[13]。

本試驗通過對此株乳酸菌株采用形態學、生理生化特性和運動性等鑒定，根據鑒定手冊可以初步判定屬于乳桿菌屬，其形態與乳酸鏈球菌相符，鑒定該乳酸菌可能為乳酸鏈球菌，但還需后續試驗證明其是否是乳酸鏈球菌。本試驗中采用OD690nm值來反應乳酸菌菌液的濃度，雖然不能得知菌體的數量，但在一定程度可以對比不同時間下的菌體濃度，且操作迅速，簡便。

乳酸菌在其生長繁殖過程中能夠產生乳酸，乳酸能夠降低動物腸道pH；可以提高鈣、磷、鐵的利用率，并促進鐵和維生素D的吸收；腸道pH降低可有效抑制致病菌，如痢疾桿菌、傷寒桿菌、副傷寒桿菌、彎曲桿菌、葡萄球菌等的生長，為有益菌的生長創造了條件[14]。培養液pH動態變化主要是由乳酸菌在生長過程中產生乳酸引起，乳酸的積累影響乳酸菌的生長，Sobrun等研究證明，乳酸菌的產酸量和生長速度成線性相關，這與本試驗的研究結果一致[15]。試驗中18 h該菌到達對數期，此時OD690nm值為2.104，18 h時菌株的產酸量到達穩定，pH為3.45，該菌較李鳳梅等選擇的乳酸菌株生長速度快，產酸量高[16]。國家標準方法酸度的定義為以酚酞作指示劑所需的標準滴定溶液的毫升數。但在本試驗中參照劉文華等研究，采用酸度計進行酸度測定，與國標法相比更方便、快捷、準確，適合實驗室操作[5]。試驗中采用CaCO3溶解圈法進行乳酸菌的分離，此法較普通方法簡單，效果明顯。因本試驗中的菌種從市售酸奶獲得，符合安全性原則，且生長速度快，產生有機酸速度快，符合本試驗的設計。

4 結論

本試驗結果表明，篩選的株菌為乳酸菌，且生長對數期為18 h，產酸速度快，產酸量高，適合作為微生物發酵飼料的菌種。

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