不同產地與規格半夏中4種核苷(或堿基)的含量測定及統計分析

阮洪根，何祿仁，宋平順，趙建邦，丁永輝

(1.蘭州大學藥學院，甘肅 蘭州 730000； 甘肅省食品藥品檢驗所·甘肅省中藥品質與安全工程技術研究中心，甘肅 蘭州 730000； 甘肅省食品藥品監督管理局，甘肅 蘭州 730000)

半夏為天南星科植物半夏 Pinellia ternate(Thunb)Breit的干燥塊莖[1]，具有鎮咳、抗心律失常、抗腫瘤、解毒抗炎的作用，臨床藥理作用廣泛[2]。吳皓等[3]從半夏水溶性成分中分離到肌苷認為是其指標成分，也是半夏藥材的鑒別成分。也有學者在半夏的水提液中檢測到尿苷[4]。除肌苷、尿苷外，從半夏中還檢測到尿嘧啶、黃嘌呤。核苷類成分參與DNA代謝過程，具有抗腫瘤、抗病毒、基因治療等多種生物活性[5]。20世紀90年代，國內開始有對半夏藥材中核苷類成分的報道，多采用高效液相色譜(HPLC)法[6]。本研究中，對半夏藥材中尿嘧啶(堿基)、黃嘌呤(堿基衍生物)、尿苷和肌苷(次黃嘌呤核苷)進行了含量測定，并對數據進行充分分析、比較，旨在對半夏的質量控制指標作進一步認識。現報道如下。

1 儀器與試藥

Waters e2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司)，包括2695-2998PDA型檢測器；萬分之一電子分析天平，Mettle-AE163型十萬分之一電子分析天平(瑞士Mettler公司)；H1650型離心機(長沙湘儀)；超聲波清洗器(昆山儀器廠)；旋轉蒸發儀，定量分析濾紙。尿嘧啶(批號為100469-200401)、黃嘌呤(批號為 140662-200301)、尿苷(批號為 887-200202)、肌苷(批號為140669-201104)對照品均購自中國藥品生物制品檢定所，純度均大于99.5%；蒸餾水。半夏藥材的采集地為甘肅天水、武都、西和、徽縣以及云南、貴州、江西、湖北等地，藥材經甘肅省食品藥品檢驗所宋平順主任藥師鑒定為天南星科植物半夏 Pinellia ternate(Thunb)Breit的干燥塊莖。半夏藥材均干燥、粉碎、過4號篩，備用。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

精密稱取尿嘧啶4.48 mg、黃嘌呤8.94 mg、尿苷6.65 mg、肌苷4.07 mg，分別定容于50 mL容量瓶中，得對照品貯備液；分別依次吸取上述對照品貯備液2，3，3，2 mL混合于10 mL容量瓶中，得混合對照品貯備液。稱取半夏藥材1.5 g，精密稱定，置磨口具塞錐形瓶中，分別加水20 mL和15 mL，超聲提取2次，每次30 min，于3 000 r/min離心10 min，抽濾，合并濾液，濾液濃縮，定容至10 mL，于3 000 r/min離心5 min，上清液過0.45 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.2 色譜條件[7]及系統適用性試驗

色譜柱:Kromasil100-5C18E51072色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相:水；流速0.8mL/min；柱溫:30℃；測定波長:254 nm；進樣量:10μL。在此條件下，色譜圖見圖1。尿嘧啶、黃嘌呤、尿苷、肌苷的保留時間依次是4.8，8.6，10.6，26.0min，理論塔板數以尿嘧啶計不低于8000，分離度優良。

2.3 方法學考察

線性關系考察:精密吸取混合對照品貯備液5 mL和2 mL分別置10 mL容量瓶中，1 mL置25 mL容量瓶中，1 mL置100 mL容量瓶中；加水稀釋至刻度，搖勻，連同原貯備液制得標準曲線對照品溶液系列。分別進樣4次，以對照品溶液的質量濃度(C)為橫坐標、峰面積平均值(Y)為縱坐標進行線性回歸，求得4個組分的回歸方程。結果見表1。

精密度試驗:稱取半夏藥材(甘肅徽縣)1.5 g，精密稱定，按2.1項下方法制備供試品溶液，進樣6次。結果尿嘧啶、黃嘌呤、尿苷、肌苷峰面積的 RSD依次為0.89%，1.21%，1.32%，1.53%(n=6)。

重復性試驗:稱取半夏藥材(甘肅徽縣)1.5 g，精密稱定，共6份，按2.1項下方法制備供試品溶液，依法進樣測定含量。結果尿嘧啶、黃嘌呤、尿苷、肌苷含量的 RSD依次為2.36%，2.23%，1.95%，2.44%(n=6)。

圖1 高效液相色譜圖

表1 線性關系考察結果

加樣回收試驗:稱取半夏藥材(甘肅徽縣)0.75 g，精密稱定，用移液器精密加入0.15 mL尿苷、0.05 mL黃嘌呤、0.50 mL尿苷、0.20 mL肌苷對照品貯備液，分別加水19.1 mL和15 mL，按2.1項下供試品溶液制備方法制備待測溶液，依法進樣測定核苷(或堿基)含量，計算回收率。結果見表2。

2.4 樣品含量測定與分析

甘肅不同產地及甘肅省外半夏藥材:稱取甘肅不同產地及甘肅省外半夏藥材樣品1.5 g，精密稱定，按2.1項下方法制備供試品溶液，依法進樣測定核苷(或堿基)含量，結果見表3。樣品聚類分析結果見圖2。

不同規格半夏藥材:稱取3個產地的不同規格(大粒、中粒、小粒)的半夏藥材，精密稱定，按2.1項下方法制備供試品溶液，依法進樣測定含量。結果見表4。

樣品嵌套設計資料方差分析:結果見表5和表6。

3 討論

制備供試品溶液時，樣品提取過程中，采用超聲后離心、上清液再抽濾的方法，提取效果好。若直接抽濾，濾液下滴速度慢、難度大，基本上無法操作。

聚類分析結果顯示，編號為1，2，3，4，5，6，8 號的樣品聚為一類，7，9，10，11，12，13 號的樣品聚為另一類。1，2，3，4，5，6，8 號樣品均為甘肅省內樣品，10，11，12，13號樣品為省外樣品。7號為引種品種，與省外聚合為一類，可見引種與省外樣品的來源一致。9號樣品不知來源，但從其與省外樣品合并為一類，可初步判定其也為引種品。因此，甘肅省與省外的半夏品種可很好地區分，顯示出其道地性。

嵌套設計資料的方差結果顯示，模型檢驗Corrected Model的F=14.727，P=0.000，所統計的數據有統計學意義；因素規格的統計量 F=0.292，P=0.749＞0.01，說明不同規格樣品間核苷(堿基)含量的差異無統計學意義，說明半夏大粒、中粒、小粒間質量無明顯差異，故規格不能作為評判半夏質量的指標。因素產地的統計量 F=39.348，P=0.000＜0.01，說明不同產地樣品間核苷(堿基)含量的差異有統計學意義，可進一步作多重比較。由LSD法多重比較結果可知，產地1(甘肅永靖)樣品的核苷含量最高，優于產地2(貴州)樣品和產地3(云南)樣品；產地2和產地3比較，P=0.686＞0.01，差異無統計學意義。

表2 加樣回收試驗結果(n=6)

表3 甘肅不同產地及甘肅省外半夏中核苷(或堿基)含量測定結果(n=4)

圖2 樣品聚類分析圖

表4 不同規格半夏藥材中核苷(或堿基)含量測定結果(n=4)

表5 主體間效應的檢驗表

表6 LSD法多重比較表

參考文獻：

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010:110-113.

[2]徐 萍，張學蘭，吳暢灝.半夏的研究進展[J].中國藥業，2003，12(3):76.

[3]吳 皓，李 偉，張科衛，等.半夏藥材鑒別成分的研究[J].中國中藥雜志，2003，28(9):836.

[4]Chen P，Li C，Liang S，et al.Characterization and quantification of eight water-soluble constituents in tuber of Pinellia ternata and in tea granules from the Chinese multiherb remedy Xiaochaihutang[J].J Chromatogr B，2006，843(2):183-193.

[5]Kinahan JJ，Kowal EP，Grindey GB.Biochemical and antitumor effects of the combination of thymidine and 1-β-D-arabinofuranosylcy tosine against eukemia L1210[J].Cancer Res，1981，41(2):445.

[6]葛秀允，吳 皓.半夏的化學成分及質量評價方法[J].中國藥業，2009，18(9):4.

[7]呂愛娟，張志澄，張科衛，等.RP-HPLC法同時測定半夏中5種核苷含量的研究[J].藥物分析雜志，2007，27(7):1 051.