三七總皂苷脈沖遲釋片體外釋放度影響因素研究

奚 煒 ，胡熙曦 ，陳進兵 ，金桂蘭，邢翔飛，黃久華

(1．三峽大學(xué)人民醫(yī)院·湖北省宜昌市第一人民醫(yī)院藥劑科，湖北 宜昌 443000；2．湖北省枝江市人民醫(yī)院藥劑科，湖北 枝江 443200)

脈沖式給藥系統(tǒng)又稱定時給藥系統(tǒng)（TCDDS）或控制突釋系統(tǒng)（controlled explosion systems）[1]，是依據(jù)時間藥理學(xué)及時辰藥代動力學(xué)原理，定時釋放有效劑量藥物的新劑型，它可根據(jù)某些疾病的生物節(jié)律性特點，定時定量釋藥，其應(yīng)用降低了耐受性和不良反應(yīng)，提高了治療的順應(yīng)性[2]。三七總皂苷作為中藥三七中提取的活性有效成分，目前主要應(yīng)用于心腦血管系統(tǒng)疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[3]。許多心血管疾病如高血壓、缺血性心臟病、心絞痛等都具有明顯的晝夜節(jié)律性，多為夜發(fā)性和晨發(fā)性疾病，故有必要研制在臨睡前服藥而凌晨釋藥的脈沖遲釋制劑，用以該類疾病的預(yù)防與治療。本研究中制備的三七總皂苷脈沖遲釋片，在體外釋放過程中延遲4～5 h后，快速脈沖式地釋藥，這對心血管疾病的預(yù)防與治療有著重要意義，為以安全、合理、高效用藥為指導(dǎo)原則的心血管疾病藥物的研發(fā)提供了理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1200LC型高效液相色譜儀，包括G1310A單元泵、G1312A二元泵、G1311A四元泵，G1316A型柱溫箱，G1314A VWD型檢測器，G1362A型示差檢測器，Agilent Technologies ChemStation；UV －1700型紫外分光光度計（Shimadzu）；BP211D 型十萬分之一電子天平（Satorius）；TDP型單沖壓片機（上海天祥健臺制藥機械有限公司）；ZRS－8G型智能藥物溶出儀（天津大學(xué)精密儀器廠）；SK2200H型超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）。三七總皂苷（昌寧德康生物科技有限公司，批號為100208）；人參皂苷Rg1對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為110703 － 201027）；羥丙甲纖維素（HPMC）、微晶纖維素（MCC）、羧甲基淀粉鈉（CMS － Na）、纖維素羧甲基醚（CCNa）、乳糖、硬脂酸鎂等均為藥用規(guī)格；乙腈、甲醇均為色譜純，水為二次蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 三七總皂苷脈沖遲釋片的制備

2．1．1 制劑處方

片芯處方（每片150 mg）：三七總皂苷100 mg，羧甲基淀粉鈉6 mg，纖維素羧甲基醚 6 mg，乳糖 38 mg，硬脂酸鎂 0．5%。

包衣處方（每片 350 mg）：HPMC（50 mPa·s）143 mg，HPMC（15 mPa·s）90 mg，乳糖 35 mg，MCC 82 mg，硬脂酸鎂 0．5% 。

2．1．2 片芯制備

將主藥過100目篩，按處方量稱取各片芯輔料，分別過100目篩，將三七總皂苷和輔料依次加入研缽中研磨，充分混勻，于單沖壓片機上壓制成片重約150 mg的片芯。

2．1．3 脈沖遲釋片制備

將外包衣層輔料過100目篩混勻，用75%乙醇制軟材，過20目篩制粒，于60℃干燥后，過24目篩整粒，加入0．5%硬脂酸鎂后混勻；按每份175 mg進行稱取，將1份外衣層顆粒填入沖模內(nèi)，將片心置于沖模中心，再填入另1份外衣層顆粒，于單沖壓片機上壓制成直徑10 mm、片重約500 mg的三七總皂苷脈沖遲釋片，每片含三七總皂苷100 mg。

2．2 體外釋放度測定方法的建立

2．2．1 測定波長選擇

精密稱取人參皂苷 Rg1對照品適量，分別用 0．1 mol／L鹽酸、pH＝6．8的磷酸鹽緩沖液和蒸餾水溶解并稀釋成適宜濃度的溶液，再分別以各自溶劑為空白，經(jīng)0．45 μm微孔濾膜過濾后于200～400 nm波長范圍內(nèi)進行紫外掃描。同時，將輔料按處方量比例用同法稀釋，經(jīng)0．45 μm微孔濾膜過濾后進行紫外掃描。結(jié)果表明，人參皂苷 Rg1分別在 0．1 mol／L鹽酸、pH ＝6．8的磷酸鹽緩沖液和蒸餾水的介質(zhì)中，在200～210 nm波長范圍內(nèi)呈末端吸收，各輔料在此波長處均無吸收；根據(jù)吸收最大、流動相干擾最小原則，結(jié)合2010年版《中國藥典(一部)》[4]的方法，選用203 nm為測定波長。

2．2．2 標準曲線繪制

精密量取人參皂苷Rg1對照品溶液適量，為了模擬人體內(nèi)環(huán)境的 pH，分別用 0．1 mol／L鹽酸、pH＝6．8的磷酸鹽緩沖液和蒸餾水溶解并配制成質(zhì)量濃度分別為 2．9，5．8，11．6，23．2，46．4 μg／mL 的標準溶液，以色譜峰峰面積為縱坐標（Y）、人參皂苷Rg1質(zhì)量濃度（μg／mL，X）為橫坐標進行線性回歸。各線性方程分別為：0．1 mol／L 鹽酸， A＝5．109 1 C ＋13．338， r＝0．999 9；pH ＝6．8的磷酸鹽緩沖液，A＝5．149 1 C ＋13．3，r＝0．999 9；蒸餾水，A＝5．122 7 C ＋13．154，r＝0．999 9。結(jié)果表明，人參皂苷Rg1在 3 種介質(zhì)中，其質(zhì)量濃度在 2．9 ～ 46．4 μg／mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系均較好。

2．2．3 穩(wěn)定性試驗

精密稱取人參皂苷Rg1對照品適量及等量處方比例輔料，分別以0．1 mol／L鹽酸、pH＝6．8的磷酸鹽緩沖液和蒸餾水為溶劑配制成高、中、低3個質(zhì)量濃度的溶液各3份，在37℃條件下保溫 24 h，分別于 0，2，6，12，24 h 定時取樣 20 μL，注入高效液相色譜儀，測定其峰面積。結(jié)果人參皂苷 Rg1在0．1 mol／L鹽酸溶液、pH＝6．8的磷酸鹽緩沖液和水溶液中測定結(jié)果的 RSD分別為0．92% ，1．25% ，1．53% ，表明 24 h 內(nèi)人參皂苷 Rg1在 37 ℃ 的上述3種介質(zhì)中的含量無明顯變化。

2．2．4 體外釋放度的測定方法

按2010年版《中國藥典（二部）》附錄ⅩC釋放度測定法第一法操作[5]，以900 mL經(jīng)脫氣處理的 pH＝6．8的磷酸鹽緩沖液為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為 100 r／min，溫度為（37 ± 0．5）℃。在預(yù)定時間間隔內(nèi)取樣5 mL，并及時補加等體積同溫新鮮介質(zhì)。樣品液根據(jù)需要濃縮，用 0．45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液 10 μL，進樣測定其峰面積，帶入標準曲線計算人參皂苷Rg1的濃度，求出三七總皂苷的累積釋放百分率 Q。

2．2．5 脈沖遲釋片體外釋放度的評價

體外釋放參數(shù)與釋放取樣點的確定：脈沖釋藥最關(guān)鍵的指標是釋藥時滯和釋藥完全的時間，本研究以藥物釋放后累積釋藥量在 10%左右時的時間點為表觀釋藥時滯（t0．1），以藥物釋放在90%左右時的時間（t0．9）代表藥物完全釋放的時間。分別考察4．5，5．5，6．5 h 三七總皂苷累積釋放百分率，4．5 h 累積釋放百分率（ Q4．5）以 10% 為標準，5．5 h 累積釋放百分率（ Q5．5）以 50% 為標準，6．5 h 累積釋放百分率（ Q6．5）以 90% 為標準[6]。

體外釋放度的評價方法：固體藥物制劑的累積釋放度曲線反映了其體外的釋藥趨勢，通過對比不同批次制劑之間的累積釋放曲線，可以判斷處方組成、工藝參數(shù)、釋放條件等因素對藥物釋放情況的影響程度。本研究采用相似因子法（f2因子法）來進行處方優(yōu)化、評價批間重現(xiàn)性。相似因子 f2的計算方法如下。

式中，Rt為 t時間參比制劑的釋放度；Tt為t時間試驗制劑的釋放度；n為取樣點的個數(shù)。f2實際上量度了2條累積釋放曲線之間累積釋放百分率的相似性。f2越大，表明2條體外釋放曲線差異越小，如果50≤f2≤100，可認為2種制劑的釋放度曲線相似。

2．3 體外釋放度的影響因素考察

2．3．1 溶出介質(zhì) pH

按同一處方量制備三七總皂苷脈沖遲釋片，分別以0．1 mol／L鹽酸、pH＝6．8的磷酸鹽緩沖液、蒸餾水為溶出介質(zhì)，測定其三七總皂苷的累積釋放百分率，考察不同溶出介質(zhì)pH對藥物釋放的影響。累積釋藥曲線見圖1 A。經(jīng)相似因子法計算，結(jié)果表明，不同pH溶出介質(zhì)中，該脈沖遲釋片的釋藥趨勢基本相同；為簡化操作，并模擬人體腸液的內(nèi)環(huán)境，本研究均以pH＝6．8的磷酸鹽緩沖液為溶出介質(zhì)進行處方篩選。

2．3．2 溶出方法

按同一處方量制備三七總皂苷脈沖遲釋片，以pH＝6．8的磷酸鹽緩沖液 900 mL為溶出介質(zhì)，控制溫度在（37±0．5）℃，調(diào)整轉(zhuǎn)速為100 r／min，分別采用槳法和轉(zhuǎn)籃法進行體外釋藥試驗，考察其對藥物釋放的影響，測定三七總皂苷的累積釋放百分率。累積釋藥曲線見圖1 B。經(jīng)相似因子法計算，結(jié)果表明，不同溶出方法下脈沖遲釋片的釋藥趨勢基本相同，但用漿法發(fā)現(xiàn)藥片容易上浮，偶爾有藥片與容器壁撞擊發(fā)生裂片造成試驗失敗。為了試驗過程的穩(wěn)定性，本研究均采用轉(zhuǎn)籃法進行試驗。

2．3．3 轉(zhuǎn)速

按同一處方量制備三七總皂苷脈沖遲釋片，以新鮮經(jīng)脫氣處理的pH＝6．8的磷酸鹽緩沖液900 mL為溶出介質(zhì)，控制溫度在（37 ± 0．5）℃，采用轉(zhuǎn)籃法，考察轉(zhuǎn)速分別為 50，75，100 r／min 時藥物的釋放情況，測定三七總皂苷的累積釋放百分率。累積釋藥曲線見圖1 C。經(jīng)直觀比較法[7]分析，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)速分別為50，75，100 r／min時，脈沖遲釋片的釋藥時滯基本相同，但藥物的釋放速度略有不同，轉(zhuǎn)速越快，藥物完全釋放的時間越短。為了使藥物在時滯后能迅速釋放，本研究均采用100 r／min的轉(zhuǎn)速進行試驗。

2．3．4 溶出介質(zhì)黏度

公攤面積動輒再收服務(wù)費惹民怨。公攤收益被物業(yè)“代持”，但物業(yè)費、供暖費、停車費等與公攤密切相關(guān)的五花八門收費卻每每如期而至，讓業(yè)主們有種說不出來的“憋屈”。

按同一處方量制備三七總皂苷脈沖遲釋片，以新鮮經(jīng)脫氣處理的蒸餾水，0．5%，1%的HPMC水溶液為溶出介質(zhì)，測定三七總皂苷的累積釋放百分率。累積釋藥曲線見圖1 D，可見，溶出介質(zhì)黏度對藥物釋放速度有一定影響，溶出介質(zhì)黏度越小，釋藥時滯越短，水向片芯內(nèi)滲透的速度越快，使藥物完全釋放的時間越短。2．4 脈沖遲釋片最佳測定條件下釋放度的重現(xiàn)性評價

圖1 不同溶出條件下藥物累積釋放曲線

在100 r／min的轉(zhuǎn)速下，以 pH＝6．8的磷酸鹽緩沖液為溶出介質(zhì)，采用轉(zhuǎn)籃法，對3批三七總皂苷脈沖遲釋片測定人參皂苷Rg1的累積釋放百分率，并用相似因子法計算 f2值來評價釋藥曲線，考察其釋藥行為的重現(xiàn)性。累積釋藥曲線見圖2。試驗結(jié)果表明，3批脈沖遲釋片的釋藥曲線無顯著性差異。第1批與第2批相比，f2＝95．48；第 2批與第 3批相比，f2＝99．70；第 1批與第 3批相比，f2＝95．14；相似因子 f2均大于50，所以不同批次脈沖遲釋片的釋藥時滯和釋藥速率均無顯著性差異，重現(xiàn)性良好。符合脈沖遲釋系統(tǒng)的釋藥要求。

圖2 3批三七總皂苷脈沖遲釋片中藥物累積釋放曲線

3 討論

本研究中脈沖控釋片的片芯采用粉末直接壓片法[8]制得，增加了藥物的崩解性和溶出度，使制得片芯在釋藥階段的釋藥速率提高，符合該脈沖控釋制劑突釋藥物的研究目的。脈沖控釋片的制備采用包衣控釋法，便于包衣層厚度的控制，遲釋效果較好。該制劑在體外釋放過程中延遲大約4～5 h后，快速脈沖式地釋藥。

三七總皂苷含有人參皂苷 Rb1，Rb2，Rc，Rd，Re，Rf，Rg1，Rg2，Rh1及三七皂苷 R1，R2，R3，R4等 20多種皂苷成分，利用高效液相色譜（HPLC）法分析測定三七總皂苷各成分時非常耗時。人參皂苷Rg1是三七總皂苷的代表性成分，根據(jù)實際情況僅以人參皂苷Rg1為測定指標進行釋放度的研究。

在 UV－1700紫外分光光度計上[9]，以乙腈 －水（20∶80）為溶劑，測得人參皂苷 Rg1在200～400 nm波長范圍內(nèi)的吸收曲線，其在200～210 nm波長范圍內(nèi)呈末端吸收；根據(jù)吸收最大、流動相干擾最小原則，確定203 nm為檢測波長。

固體制劑的主藥成分，尤其是難溶性的主藥成分，它的釋放和溶解直接影響主藥的吸收速率和程度。因此，測定釋放度在一定程度上可間接反映藥物在體內(nèi)被吸收的情況。釋放度是評價藥物體外釋藥效果的重要指標，研究中藥固體制劑釋放度對于新藥研制、劑型選擇、探討藥物體內(nèi)外相關(guān)性、預(yù)測藥物體內(nèi)過程、控制產(chǎn)品質(zhì)量、優(yōu)選處方和工藝改進及合理用藥都具有重要的現(xiàn)實意義。通常測定中藥固體制劑釋放度指標有分光光度法和色譜法2種，但中藥（單方或復(fù)方）制劑成分復(fù)雜，用分光光度法所得測定結(jié)果易受其他成分的干擾，大大降低了儀器的靈敏度和結(jié)果的準確性。綜合考慮，本研究中采用分離度和準確度均較高的HPLC法來測定釋放液中三七總皂苷的累積釋放百分率，使之能夠準確表示被測成分的釋放情況，以此評價釋放狀況并篩選處方。

由于制備的脈沖遲釋片經(jīng)4～5 h的時滯后才開始釋藥，此時制劑應(yīng)進入小腸部位。為了更好地模擬脈沖遲釋片在體內(nèi)的真實釋藥環(huán)境，同時考慮到藥物的漏槽條件，故選取pH＝6．8的磷酸鹽緩沖液為釋藥介質(zhì)。

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