葡萄糖腦苷脂酶基因多態性與帕金森病的相關性研究

司君增，魏麗萍，郭秀玲，宋方禹，亓勤德

（萊蕪市人民醫院神經內科，山東 萊蕪 271199）

·論著·

葡萄糖腦苷脂酶基因多態性與帕金森病的相關性研究

司君增，魏麗萍，郭秀玲，宋方禹，亓勤德

（萊蕪市人民醫院神經內科，山東 萊蕪 271199）

目的研究中國山東人群帕金森病患者的葡萄糖腦苷脂酶(Glucocerebrosidase，GBA)基因N370S、V394L和L444P突變位點多態性，探討GBA基因突變與帕金森病的相關性。方法應用PCR產物直接DNA測序法對60例帕金森病患者及60例正常對照組的9、10號外顯子進行檢測，然后進行測序對比分析。結果測序結果顯示帕金森病患者和正常對照組的GBA基因外顯子9和外顯子10核苷酸序列完全一致，未發現突變點。結論該研究不支持GBA基因N370S、V394L和L444P突變位點是中國山東人群帕金森病的危險因素。

帕金森病；葡萄糖腦苷脂酶基因；基因突變

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一種中老年人常見的運動障礙疾病。由于該病具有較強的致殘性，嚴重影響了患者的正常工作及生活，給患者家屬及社會帶來了沉重的負擔，已成為社會關注的焦點之一[1]。研究易感候選基因是探索PD這種復雜疾病的關鍵步驟。近年來，GBA基因成為研究的熱點，而且，不同種族不同區域人群有遺傳異質性，之前的研究結果不一[2-3]。重要的是，中國人群PD患者基數龐大，中國大陸山東人群尚未有類似報道，說明開展對山東人群的GBA基因與PD相關性的深入研究，具有重要的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料病例組系2011年9月至2013年7月山東省萊蕪市人民醫院、山東大學齊魯醫院、山東省立醫院神經內科門診及住院的帕金森病患者，帕金森病的診斷參照英國腦庫的診斷標準。對照組系萊蕪市人民醫院門診健康體檢人員，排查錐體外系及其他神經系統變性疾病。病例組及對照組各60例，均為山東地區漢族，性別及年齡分布兩組間差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 提取基因組DNA抽取研究對象外周靜脈血5 ml，用乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)抗凝。常規酚/氯仿法提取基因組DNA。

1.2.2 聚合酶鏈擴增反應(PCR)引物合成真、假基因具有高度同源性，首先將真假基因區分開，在此基礎上分別擴增單個外顯子；參照相關文獻設計引物[2]，由上海生工公司合成。引物序列見表1(均為5'-3'方向)。

表1 GBA基因PCR引物序列

1.2.3 PCR反應條件94℃預變性5 min，94℃變性5 min，退火45 s(外顯子8～11、外顯子9、外顯子10的退火溫度分別為40℃、50℃、50℃)，72℃延伸1 min，30個循環，最后72℃終延伸7 min。1.5%瓊脂糖凝膠檢驗PCR擴增產物。反應體系總體積25 μl，包括ddH2O、10×PCR buffer、5 mmol/L的4種dNTP、5 mmol/L的MgCl2、10 μmol/L引物A(正向)、10 μmol/L引物A(反向)、模板DNA、TaqDNA聚合酶(5 U/μl)。

1.2.4 序列測定從瓊脂糖凝膠中回收擴增外顯子9、外顯子10的PCR產物，純化產物測序委托上海生工公司和北京天根公司完成，測序結果與Gene-Bank提供的序列用Blast軟件進行比對；根據比對結果判別基因有無突變。

2 結果

2.1 瓊脂糖凝膠電泳結果通過PCR擴增反應，GBA基因第8～11外顯子擴增成功(擴增片段長度1 682 bp，見圖1)，將其產物純化后作為模板擴增GBA基因外顯子9(擴增片段長度362 bp，見圖2)和外顯子10(擴增片段長度329 bp，見圖3)也擴增成功，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示為相應特異長度的單一條帶，部分電泳圖如下：

圖1 8～11號外顯子條帶（1 682 bp）

圖2 9號外顯子條帶（362 bp）

圖3 10號外顯子條帶（329 bp）

2.2 DNA直接測序結果測序結果經序列比對后PD病例組和對照組均未發現GBA基因9號外顯子N370S(見圖4)突變和V394L(見圖5)突變，也未發現10號外顯子L444P(見圖6)突變。部分測序峰圖如下：

圖4 N370S突變：圖中68位A→G

圖5 V394L突變：圖中139位G→T

圖6 L444P突變：圖中118位T→C

3 討論

葡萄糖腦苷脂酶(GBA)基因定位于人染色體1q21。基因全長為7.6 kb，含11個外顯子；假基因位于下游16 kb。在同源區內，96%的核苷酸是一致的[4]。因此研究GBA基因，尤其在研究GBA基因的多態性時，前提必須將真、假基因區分開，否則課題研究將導致一系列的誤差，本文根據真假基因序列的差異而設計的特異引物首先擴增真基因的外顯子8～11，此引物與假基因不能結合從而不能擴增假基因，從而將此片段的真假基因區分開，然后根據每個外顯子設計相應引物擴增單個外顯子[2]。

GBA基因編碼由536個氨基酸組成的葡萄糖腦苷脂酶，該酶將葡萄糖腦苷脂水解為神經酰胺被機體再利用。GBA基因突變導致葡萄糖腦苷脂酶活性降低，不能將葡萄糖腦苷脂水解為神經酰胺，釋放的葡糖腦苷脂就會被網狀內皮系統(脾、肝、骨髓)中的巨噬細胞吞入并儲存于其溶酶體中形成十分獨特的微管狀結構，進而干擾正常細胞凋亡[5]。

戈謝病(Gaucher's disease)是一種常染色體隱形遺傳疾病，稱葡萄糖神經酰胺貯積病，一般認為其病因源于葡萄糖腦苷脂酶(GBA)基因突變導致該酶活性降低，造成葡萄糖腦苷脂酶在網狀內皮組織巨噬細胞中的大量沉積，出現了特征表現的戈謝細胞。目前已經報道的GBA基因突變有200多種，其中常見的有N370S、84GG、L444P，V394L，研究發現在猶太民族戈謝患者中N370S突變占到78%，而在非猶太民族戈謝病患者中最常見的突變則是L444P(36%)，其次是N370S(23%)[6-7]，因此本研究選取了以上突變頻率最高的三個位點N370S、V394L和L444P進行研究。

我們的研究結果發現60例帕金森病患者和60例正常對照的GBA基因的外顯子9、10的核苷酸序列完全一致，未發現基因突變，這與焦玲等[8]對中國貴州人群的研究報道結果相一致。該研究也未發現V394L和L444P突變，但在挪威、巴西、以色列、意大利、臺灣、新加坡華裔人群等PD患者的研究中卻發現了這兩個位點的突變[9-15]。這種差異可能是因為我們的研究樣本量相對較小，或者是地區、種族差異引起。

國外學者研究以色列德系猶太人帕金森病患者的GBA基因突變，N370S是最常見突變位點；挪威學者對311例PD患者GBA基因進行篩查，結果發現7例有基因突變的患者中有4例為N370S突變；然而臺灣及新加坡華裔人群PD患者的GBA基因測序分析未發現N370S突變[12]。因此，我們推測N370S位點不是亞洲人群的突變熱點，而是歐洲、美洲等發達國家PD患者GBA基因的突變熱點，同時也表明GBA基因N370S多態性可能因人群種族和地區不同而存在差異性。

盡管本研究我們未發現PD患者及正常對照組的葡萄糖腦苷脂酶基因突變，但不能就此排除在帕金森病的發病機制中，GBA基因突變參與發病的可能性，在以后的研究中，我們將增大PD患者樣本量及基因位點的監測，為進一步闡明PD的發病機制提供寶貴的基礎資料。

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Association between glucocerebrosidase genetic polymorphisms and Parkinson's disease.

SI Jun-zeng,WEI Li-Ping,GUO Xiu-ling,SONG Fang-yu,QI Qin-de.Department of Neurology,Laiwu People's Hospital,Laiwu 271199, Shandong,CHINA

ObjectiveTo study the polymorphisms of Glucocerebrosidase(GBA)gene mutation sites (N370S,V394L and L444P)in patients with Parkinson's disease in Shandong province of China,and to explore the relationship between GBA gene and Parkinson's disease(PD).MethodsExon 9 and exon 10 of GBA gene were amplified the in 60 PD patients and 60 normal controls by polymerase chain reaction(PCR).PCR products were analyzed by direct DNA sequencing.BLAST was used for sequences analysis.ResultsThe sequence results demonstrated that the nucleotide sequences of exon 9 and exon 10 of GBA gene in the patients of Parkinson's disease and normal controls were the same,with no mutation found.ConclusionThe GBA gene mutation sites(N370S,V394L and L444P)may not be risk factors for PD in Chinese Shandong population.

Parkinson's disease;Glucocerebrosidase gene;Gene mutation

R742.5

A

1003—6350（2014）07—0944—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.07.0367

2013-10-25)

萊蕪市人民醫院科研立項課題（編號：yylx2013022）

司君增。E-mail：sjz2835@163.com