俄色葉HPLC 指紋圖譜建立及7 種成分測定

徐俊陳華林陳蓉康晉梅李敏

（成都中醫藥大學，中藥材標準化教育部重點實驗室，省部共建西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川成都611137）

俄色葉為薔薇科蘋果屬植物變葉海棠Malus toringoide（Rehd.）Hughes.或花葉海棠Malus transitoria（Batal.）Schneid.的干燥葉及葉芽［1］，在《四部醫典》［2］、《晶珠本草》［3］、《藏藥晶鏡本草》［4］中均有記載，具有攻堅化積、除膩滌滯、保肝利膽的功效，它已被開發的雪域俄色茶［5-9］、功能性食品［10-11］、保肝藥物［12-13］、俄色黃酮分子膠囊［14］、俄色-A 毛囊靶向脂質體［15］、俄色總黃酮緩釋栓劑與片劑［16-17］、俄色黃酮微囊［18］、俄色黃酮-β-環糊精包合物［19］、復方顆粒劑［20-21］等，在藥用、食用方面均具有重要價值。另外，該屬植物包括多種海棠，在性狀、成分方面存在相似性［22］。

目前，俄色葉質量標準僅以根皮素為含量測定指標，不能有效地控制其質量［23］。因此，建立俄色葉HPLC 指紋圖譜，并同時測定綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素、根皮素的含量，以期為完善該藥材質量標準提供參考。

1 材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；KQ-500DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SQP 電子分析天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］；Milli-Q Advantage A10 超純水儀（德國默克密理博公司）。

1.2 試劑與藥物 綠原酸（批號wkq16052705）、金絲桃苷（批號wkq16050305）、異槲皮苷（批號wkq16050607）、槲皮苷（批號wkq17113002）、根皮 苷（批 號 wkq17122002）、槲皮素（批 號wkq17072005）、根皮素（批號wkq17081715）對照品均購自四川省維克奇生物科技有限公司，純度均大于98 %。乙腈、甲醇為色譜純；磷酸等其他試劑均為分析純；水為超純水。

1.3 藥材 俄色葉共13 批（編號S1～S13），經成都中醫藥大學李敏教授鑒定為薔薇科植物變葉海棠Malus toringoides（Rehd.）Hughes.或花葉海棠Malus transitoria（Batal.）Schneid.的干燥葉或葉芽，具體信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法

2.1 HPLC 指紋圖譜建立

2.1.1 色譜條件 Insertsil ODS-3 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.1% 磷酸（B），梯度洗脫（0～10 min，10%～12% A；10～15 min，12%～15% A；15～16 min，15%～18% A；16～60 min，18% A；60～65 min，18%～22% A；65～70 min，22%～25%A；70～80 min，25%～30%A；80～85 min，30%～40%A；85～92 min，40%A；92～100 min，40%～52%A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長340 nm；進樣量10 μL。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取對照品綠原酸、槲皮素各1 mg，金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷各2 mg，根皮苷10 mg，根皮素5 mg，置于25 mL 量瓶中，50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 取藥材細粉（過四號篩）約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL75% 甲醇，稱定質量，超聲提取45 min，放冷，75% 甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.4 方法學考察

2.1.4.1 精密度試驗 取同一份供試品溶液（S2），在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得各成分色譜峰相對峰面積RSD 為0.12%～2.06%，相對保留時間RSD 為0.02%～0.34%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.2 重復性試驗 取同一批樣品（S2），按“2.1.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得各成分色譜峰相對峰面積RSD 為0.07%～2.42%，相對保留時間RSD 為0.03%～0.23%，表明方法重復性良好。

2.1.4.3 穩定性試驗 取同一份供試品溶液（S2），于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得各成分色譜峰相對峰面積RSD 為0.28%～2.71%，相對保留時間RSD 為0.01%～0.57%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.1.5 圖譜生成 取13 批樣品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，記錄色譜圖，將相關數據導入“色譜指紋圖譜相似度評價系統”2012A版，采用共有模式圖譜生成對照指紋圖譜（R）［24］。同時取對照品溶液適量，對其中7 個色譜峰進行指認定性，見圖1～2。由此可知，13 批樣品HPLC 指紋圖譜中有17 個共有峰，指認出其中7個，即5 號峰為綠原酸，8 號峰為金絲桃苷，9 號峰為異槲皮苷，11號峰為槲皮苷，12 號峰為根皮苷，13 號峰為槲皮素，14 號峰為根皮素。再采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012A版，以共有模式圖譜（R）為參照，發現其相似度良好，為0.948～0.993。

圖1 13 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints for thirteen batches of samples

圖2 各成分HPLC 色譜圖（Ⅰ）Fig.2 HPLC chromatograms of various constituents（Ⅰ）

2.2 聚類分析 以7 個共有峰的相對峰面積為原始數據，采用SPSS 25.0 軟件中的組間平均數聯結法進行聚類分析，結果見圖3。由此可知，13 批樣品可聚為3類，S1、S3、S5、S7、S8 為第1類，S10、S11、S12、S13 為第2類，S2、S4、S6、S9為第3 類。

圖3 13 批樣品聚類分析圖Fig.3 Cluster analysis diagram for thirteen batches of samples

2.3 7 種成分含量測定

2.3.1 色譜條件 Insertsil ODS-3 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.1% 磷酸（B），梯度洗脫（0～5 min，12%～15% A；5～15 min，15%～20% A；15～28 min，20% A；28～48 min，20%～42% A；48～50 min，42%～50% A；50～55 min，50%～12% A）；體積流量0.7 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長340 nm；進樣量10 μL。

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱取各對照品適量，置于不同25 mL 量瓶中，75%甲醇溶解并定容，制得貯備液，分別取適量至同一10 mL 量瓶中，75%甲醇稀釋，即得（綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素質量濃度分別為0.125、0.35、0.86、0.38、9.3、0.01、0.85 mg／mL）。

2.3.3 供試品溶液制備 同“2.1.3”項。

2.3.4 系統適應性試驗 取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖4。由此可知，各成分分離度和理論塔板數良好，陰性無干擾。

圖4 各成分HPLC 色譜圖（Ⅱ）Fig.4 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.5 方法學考察

2.3.5.1 線性關系考察 精密吸取對照品溶液4 000、2 000、1 000、600、250 μL，置于不同10 mL量瓶中，75% 甲醇制成系列質量濃度，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定。以對照品峰面積為縱坐標（Y），進樣量為橫坐標（X）進行回歸，見表2。由此可知，各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.5.2 精密度試驗 取對照品溶液適量，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定6次，每次10 μL，測得綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素、根皮素峰面積RSD 分別為1.63%、0.12%、0.22%、0.57%、0.21%、0.94%、0.85%，表明儀器精密度良好。

2.3.5.3 重復性試驗 精密稱取藥材粉末（S6）6份，每份0.5 g，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下各進樣10 μL測定，測得綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素、根皮素峰面積RSD 分別為0.98%、1.15%、0.96%、1.40%、0.85%、1.34%、1.86%，表明該方法重復性良好。

2.3.5.4 穩定性試驗 取同一份供試品溶液（S6），室溫下于 0、2、4、8、12、24 h 在“2.3.1”項色譜條件下各進樣10 μL 測定，測得綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素、根皮素峰面積RSD 分別為0.63%、0.38%、0.54%、1.92%、0.51%、1.77%、0.60%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.3.5.5 加樣回收率試驗 精密稱取各成分含量已知的藥材粉末（S6）6份，每份0.25 g，按100%水平加入對照品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素、根皮素平均加樣回收率分別為96.4%、99.5%、99.8%、100.1%、99.9%、99.0%、99.9%，RSD 分別為 1.3%、1.0%、0.7%、0.8%、0.4%、2.9%、0.7%。

2.3.5.6 樣品含量測定 結果見表3。

表3 各成分含量測定結果（%， n＝3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（%， n＝3）

3 討論

本實驗考察不同流動相（甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸）、檢測波長（256、286、330、340、345、350、355、360 nm），結合分離度、色譜峰數目和峰形、基線平穩程度，最終分別確定為乙腈-0.1%磷酸、340 nm。再考察不同提取方法（超聲、加熱回流）、提取溶劑（甲醇、50%甲醇、75%甲醇、乙醇）、超聲時間（30、45、60 min），最終確定為75%甲醇超聲提取45 min。

聚類分析結果顯示，13 批俄色葉聚為3類，與該藥材來源和藥用部位存在一定相關性，其中葉芽中各成分總含量高于葉中。另外，S8 與S2、S4、S9 的相似度較低，表明不同基原俄色葉在成分含量上可能存在一定差異。

俄色葉中異槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、根皮素含量較高，而綠原酸、金絲桃苷、槲皮素較低。上述7 種成分均具有保肝、抗氧化、保護心血管等藥理活性［25-30］，可為全面評價俄色葉質量提供參考。