唑來膦酸對胃癌細胞株SGC-7901體外抗增殖及對VEGF的影響

姚強，閔科，鄧建良，許春妮，金俊

（江蘇大學附屬宜興醫院腫瘤科，江蘇 宜興 214200）

唑來膦酸對胃癌細胞株SGC-7901體外抗增殖及對VEGF的影響

姚強，閔科，鄧建良，許春妮，金俊

（江蘇大學附屬宜興醫院腫瘤科，江蘇 宜興 214200）

目的研究唑來膦酸對胃癌細胞株SGC-7901的體外增殖抑制作用及對血管內皮生長因子(VEGF)的影響。方法采用CCK-8試驗檢測唑來膦酸對胃癌細胞株SGC-7901的生長抑制作用；酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和半定量RT-PCR法檢測藥物對VEGF表達水平的變化。結果0.2～3.2μg/L的唑來膦酸能顯著抑制SGC-7901細胞的增殖，且具有時間及劑量依賴性，不同藥物濃度作用后，胃癌細胞株VEGF的蛋白及基因表達水平均明顯降低(P＜005)，具有濃度依賴性。結論唑來膦酸能抑制胃癌細胞株SGC-7901的生長增殖，其作用機制可能為下調VEGF表達。

唑來膦酸；胃腫瘤；血管內皮生長因子

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一[1]，目前主要以手術、化療及放療為主要治療手段。胃癌在早期就易發生侵襲及轉移，如何提高患者的生存率及生活質量成為治療關鍵。唑來膦酸(ZOL)是第三代雙膦酸鹽類藥物，多個臨床前研究顯示ZOL具有一定的抗腫瘤作用[2-4]。本研究以人胃癌細胞株SGC-7901為研究對象，進一步探討唑來膦酸的抑瘤機理。

1 材料與方法

1.1 材料胃癌細胞株SGC-7901由南京醫科大學實驗室提供，唑來膦酸(澤泰，瑞士諾華制藥產品)RPIl640購自Hyclone公司，新生牛血清購自蘭州民海生物工程有限公司，CCK-8試劑盒、VEGF酶免試劑盒購自上海銳賽生物有限公司，引物由美國Invitrogen公司合成。VEGF引物上游：5'-CCTGGTG-GACATCTTCCAGGAGTACC-3'，下游：5'-GGAGCT CATCTCTCCTATGTGCTGGC-3，擴增片段360 bp；β-actin引物上游：5'-AGAAGATGACCCAGATCATGTT-3'，下游：5'-CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3'，擴增片段290 bp。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養細胞在含10%滅活新生小牛血清的RPMI-l640培養基(含0.1%的青、鏈霉素)中培養，生長至70%～80%融合時將細胞用0.25%胰酶消化后傳代，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖抑制取對數生長期細胞，細胞濃度為5×104/ml加入96孔培養板中，每孔100μl，每組設5個復孔，并設空白對照組，12 h細胞貼壁后棄去培養基，分別加入終濃度為0.2μg/L、0.4μg/L、0.8μg/L、1.6μg/L、3.2μg/L的ZOL培養基，置于37℃、5%CO2飽和濕度溫箱中繼續培養24 h、48 h，每孔加入10μl CCK-8溶液，繼續孵育4 h，用酶標儀450 nm測定每孔吸光度(A值)，記錄結果；實驗計算公式為：細胞增殖抑制率(%)=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%，實驗重復3次。

1.2.3 ELISA法檢測VEGF水平常規培養細胞，取對數生長期細胞用于實驗，濃度分別為0μg/L、0.2μg/L、0.4μg/L、0.8μg/L、1.6μg/L、3.2μg/L的ZOL培養基作用于胃癌細胞24 h，取離心后的細胞上清用于檢測，預實驗有選擇性的稀釋待測標本，計算各標本的VEGF值，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 半定量RT-PCR法檢測VEGF-mRNA表達取對數生長期細胞用于實驗，ZOL濃度為0μg/L、0.8μg/L、1.6μg/L的細胞培養基作用胃癌細胞48 h，以Trizol一步法提取總RNA，吸取4μl RNA樣品，加水至1 ml，在紫外分光光度計上對RNA進行定量分析，確定RNA純度。逆轉錄cDNA，擴增VEGF、β-actin(內參)。PCR反應體系：25μl反應體系，5× PCR Buffer 5μl，200μmol/L dNTPs 2.5μl，1.5 mmol/L Mg2+1.5μl，上下游引物濃度為0.2μmol/L，各0.5μl，Taq酶2 U(0.5μl)，雙蒸水12.5μl，cDNA 2μl。VEGF反應條件：94℃5 min，94℃45 s，56℃30 s，72℃50 s，35個循環，72℃延伸10 min；β-actin反應條件：94℃5 min，94℃45 s，51℃30 s，72℃50 s，35個循環，72℃延伸10 min。取5μl反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠經Bio-RAD凝膠成像分析儀及GENE Tolls軟件分析系統進行分析，測定各條帶的灰度值，各組圖像灰度值的均數與內參β-actin均數的比值即為VEGF-mRNA相對表達量。

1.3 統計學方法實驗資料采用SPSS l7.0統計軟件包分析，實驗數據均采用均值±標準差()表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ZOL對胃癌細胞株的增殖抑制作用CCK-8實驗結果顯示，0.4μg/L的唑來膦酸在24 h及48 h的細胞相對增值率為(35±1.2)%和(58±2.3)%，0.8μg/L的唑來膦酸在24 h及48 h的細胞相對增值率為(40± 2.5)%和(70±1.9)%。結果表明，不同濃度唑來膦酸對胃癌細胞株SGC-7901均有明顯的增殖抑制作用，且具有時間、劑量依賴性(P＜0.05)，見圖1。

圖1 ZOL對SGC-7901細胞增殖抑制作用

2.2 細胞上清VEGF水平變化結果顯示ZOL作用于SCGC-7901細胞24 h后，隨著藥物濃度的增加，VEGF水平逐漸降低，唑來膦酸濃度為0.8μg/L時VEGF抑制率為42%，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖2。

圖2 不同唑來膦酸濃度下VEGF水平變化

2.3 半定量RT-PCR法檢測VEGF mRNA表達水平變化0μg/L、0.8μg/L、1.6μg/L的ZOL作用于胃癌細胞48 h后，進行半定量RT-PCR檢測，實驗成功擴增出相應PCR產物，各組圖像灰度值數據為(0.81±0.08)、(0.42±0.07)、(0.23±0.05)，各實驗組與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖3。

圖3 半定量RT-PCR檢測VEGF-mRNA表達水平

3 討論

唑來膦酸是20世紀中期開發的一種骨吸收抑制劑藥物，臨床上主要用于治療骨代謝障礙疾病，預防和治療惡性腫瘤骨轉移導致的一系列骨相關事件。近來大量的體內外試驗證明唑來膦酸能直接抑制腫瘤細胞的增殖、分化、誘導細胞凋亡，降低腫瘤細胞的遷移、侵襲能力[5]。有關肺癌、乳腺癌、前列腺癌及肝癌等前期臨床試驗提示唑來膦酸與細胞毒藥物、內分泌藥物及靶向藥物聯合具有一定程度的協同抗腫瘤作用，并且在抗腫瘤藥物之后序貫應用效果更好[6-7]。兩個正在進行中的大型臨床研究(SWOG)-S0307和NATAN旨在比較唑來膦酸與其他雙磷酸鹽類輔助治療乳腺癌的作用以及比較唑來膦酸聯合紫杉類化療與單純化療治療乳腺癌的療效差異。該兩項研究的結果將為唑來膦酸潛在抗腫瘤的作用提供新的依據[8-9]。

目前知道的最重要的血管調控因子是VEGF[10-11]。過去認為VEGF主要通過作用于間質的血管內皮細胞發揮作用，并對內皮細胞有促進有絲分裂和存活的作用。但最新的研究表明腫瘤細胞表面也有VEGF信號通路的調節，因此阻斷VEGF信號傳導通路可以從多個方面抑制腫瘤的生長。本研究提示唑來膦酸從蛋白及基因水平均可抑制胃癌細胞SGC-7901的VEGF表達。

綜上所述，唑來膦酸作為第三代雙膦酸鹽類藥物，不但能抑制胃癌細胞SGC-7901的增殖，同時還抑制了VEGF的表達，值得進行進一步研究。

[1]Yokobori T,Mimori K,Iwatsuki M,et a1.p53 altered FBXW7 expression determines poor prognosis in gastric cancer cases[J].Cancer Res,2009,69∶3788-3794.

[2]Morgan G,Child J,Gregory W,et al.Effects of zoledronic acid versus clodronic acid on skeletal morbidity in patients with newly diagnosed multiple myeloma(MRC Myeloma IX)∶secondary outcomes from a randomised controlled trial[J].Lancet Oncol,2011,12(8)∶743-752.

[3]Ressler S,Mlineritsch B,Greil R.Zoledronic acid for adjuvant use in patients with breast cancer[J].Expert Rev Anticancer Ther, 2011,11(3)∶333-349.

[4]Pandya KJ,Gajra A,Warsi GM,et al.Multi-center,randomized, phase 2 study of zoledronic acid in combination with docetaxel and carboplatin in patients with unresectable stageⅢB or stage IV non-small cell lung cancer[J].Lung Cancer,2010,67(3)∶330-338.

[5]戴廣海,吳志勇,石燕,等.伊班膦酸鈉對人乳腺癌細胞系MDA-MA-23、MDA-MB-453的體外生長抑制作用[J].現代腫瘤醫學,2007,15(6)∶744-747.

[6]Rack B,Juckstock J,Genss EM,et al.Effect of zoledronate on persisting isolated tumor cells in patients with early breast cancer[J]. Anticancer Res,2010,30(5)∶1807-1813.

[7]Mahtani R,Khan R,Jahanzeb M.The potential application of zoledronic acid as anticancer therapy in patient s with non-small-cell lung cancer[J].Clin Lung Cancer,2011,12(1)∶26-32.

[8]Duchesne G,Woo H,Howell D,et al.Tribulations of a prostate cancer trial-lessons learned from TOAD,a cancer council victoria and transtasman radiation oncology group trial[J].J Med Imaging Radiat Oncol,2010,54(5)∶508-511.

[9]Clinical Trials.gov.Postoperative use of zoledronic acid in breast cancer patient s after neoadjuvant chemotherapy(NATAN)[EB/ OL].Available at∶http∶//clinicalt rials.gov/ct2/show/NCT00512993 Accessed July 10,2010.

[10]Hatva E,Bohling T,Jaaskelainen J,et al.Vascular growth factors and receptors in capillary hemangioblastomas and hemangiopericytomas[J].Am J Pathol,1996,148∶763-775.

[11]Cornali E,Zietz C,Benelli R,et al.Vascular growth factor regulate angiogenesis and vascular permeability in Kaposi's sarcoma[J]. Am J Pathol,1996,149∶1851-1869.

Proliferation inhibition function of zoledronic acid on human gastric cancer cell SGC-7901 and its influence on VEGF.

YAO Qiang,MIN Ke,DENG Jian-liang,XU Chun-ni,JIN Jun.Department of Medical Oncology,the Yixing Hospital Affiliated to Jiangsu University,Yixing 214200,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo investigate the proliferation inhibition function of zoledronic acid on human gastric cancer cell SGC-7901 and its influence on vascular endothelial growth factor(VEGF).MethodsCCK-8 cell viability assay was performed to investigate the effect of zoledronic acid on cell proliferation.The expression of VEGF was examined by ELISA and semi-quantitative RT-PCR.ResultsZoledronic acid inhibited the proliferation of SGC-7901 cells at a dose-and-time dependent manner(concentration range∶0.2～3.2μg/L).Meanwhile,ELISA and semi-quantitative RT-PCR results showed that the expression of VEGF was down-regulated at a dose-dependent fashion in SGC-7901 cells.ConclusionZoledronic acid might inhibit the proliferation of SGC-7901 cells through down-regulation of VEGF.

Zoledronic acid;Gastric cancer;VEGF

R735.2

A

1003—6350（2014）19—2819—03

2014-01-13)

許春妮。E-mail：staff911@yxph.com

doi∶10.3969/j.issn.1003-6350.2014.19.1111