HPLC法同時測定松塔中槲皮素和山奈酚含量

張志琴，宿軼冬，劉光明，郭向群

(1.楚雄醫藥高等專科學校 藥學系，云南 楚雄 675005；2.楚雄技師學院，云南 楚雄 675000；3.大理學院 藥學與化學學院，云南 大理 671000)

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HPLC法同時測定松塔中槲皮素和山奈酚含量

張志琴1，宿軼冬2，劉光明3，郭向群1

(1.楚雄醫藥高等專科學校 藥學系，云南 楚雄 675005；2.楚雄技師學院，云南 楚雄 675000；3.大理學院 藥學與化學學院，云南 大理 671000)

目的：建立高效液相色譜法測定松塔藥材中兩種有效成分槲皮素和山奈酚的含量測定方法。方法：色譜柱為InertSustain C18(250mm×4.6mm，5μm)，流動相為乙腈(A)-0.1% 磷酸(B)，梯度洗脫；流速為1.0mL/min；檢測波長為360nm。結果：松塔中槲皮素在0.034～0.272μg進樣量范圍內(r = 0. 999 9)，山奈酚在0. 039～0. 317μg進樣量范圍內(r=0.999 8)與各自峰面積積分呈良好的線性關系，槲皮素平均回收率為99.74%(RSD=1.92%)，山奈酚為98.33%(RSD=1.36%)。結論：該法靈敏度高，操作簡便，結果準確可靠，可作為評價松塔藥材質量的依據。

松塔；槲皮素；山奈酚；HPLC

松科松屬植物在全世界范圍內約有80余種，分布于北半球，可直達北極圈，在熱帶和亞熱帶地區只生長于山地。我國有22種，10個變種，另引進16種，2個變種，合計50余種，分布廣泛[1]。松塔系松科(Pinaceae)松屬(Pinus)植物的球果，別名松球、松實、松元，曾收載于《中國藥典》1977年版一部[2]，具有祛痰、止咳、平喘的功效。據文獻報道，從松屬植物中分離到的化學成分主要有萜類、黃酮、木質素、多糖等[3-4]，具有抗腫瘤、抗病毒、增強免疫力等生物活性[5-7]，具有重要的藥物開發價值。為進一步開發利用該植物資源，本文對采自云南的三種松塔中的槲皮素和山奈酚含量進行測定，現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀LC-20A(日本島津)，二級管陣列檢測器SPD-M20A(日本島津)，自動進樣器SPD-M20A(日本島津)。SartoriusAGBS110S電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)。

1.2 試藥

槲皮素對照品(批號為100081-200907，中國食品藥品檢定研究院)；山奈酚對照品(批號為110861-200808，中國食品藥品檢定研究院)；乙腈為色譜純；水為超純水；其他試劑為分析純。松塔藥材采自云南省大理州和怒江州，經大理學院生藥教研室周濃鑒定為云南松(PinusyunnanensisFranch)、華山松(PinusarmandiiFranch)和喬松(PinuswallichianaA. B. Jackson)。

2 實驗方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱: InertSustainC18(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0min：15%A；15min：40%A；25min：20%A) ；檢測波長：360nm；流速：1.0mL /min；柱溫：30℃；進樣量：10μL。

2.2 對照品制備

分別取槲皮素和山奈素對照品適量，精密稱定，加無水甲醇制成每毫升分別含槲皮素0.170mg和山奈酚0.198mg的混合溶液作為貯備液。精密吸取貯備液1mL，稀釋至10mL，即得。

2.3 供試品溶液制備

取65目松塔粉末約0.5g，精密稱定，精密加入甲醇-25%鹽酸(4∶1)混合溶液50mL，稱定質量，加熱回流1h，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 線性關系考察

按“2.1”項下色譜條件，精密吸取對照品溶液2、4、8、10、12、16μL，分別注入液相色譜儀，測定槲皮素與山奈酚峰面積。以進樣量(μg)為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，其回歸方程分別為Y =6×106X-131.2，r=0.999 9和Y=4×106X-777.6，r=0.999 8。結果表明，在上述色譜條件下，槲皮素在0.034～0.272μg進樣量范圍內，山奈酚在0.039～0.317μg進樣量范圍內與各自峰面積積分呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗

取同一份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，連續測定6次，分析槲皮素和山奈素峰面積積分值，其RSD分別為1.54%和0.92%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗

平行操作制備供試品溶液6份，吸取供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。槲皮素和山奈酚質量分數RSD分別為1.38%和1.03%，表明該方法重現性良好。

2.7 穩定性試驗

制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24h吸取供試品溶液10μL，按“2.1”項下色譜條件進樣分析并記錄峰面積。槲皮素和山奈酚峰面積RSD分別為1.05%和1.12%，表明樣品溶液在24h內穩定。

2.8 回收率試驗

取已知槲皮素與山奈酚含量的松塔粉末0.5g，精密稱定，共稱取6份，每份分別加入一定量的槲皮苷與槲皮素對照品，按供試品制備方法制成供試品溶液，并按含量測定方法進行測定。試驗結果表明，槲皮素平均回收率為99.74%(n=6)，RSD=1.92%，山奈酚平均回收率為98.33%(n=6)，RSD=1.33%，表明該測定方法結果準確。回收率試驗結果見表1。

表1 槲皮素和山奈酚加樣回收試驗結果

2.9 樣品測定

分別取采自云南大理地區和怒江地區的6批樣品，按照供試品溶液制備方法操作，然后按照“2.1”項色譜條件測定供試品中槲皮素和山萘素的含量，對照品和供試品色譜見圖1，含量測定結果見表2。

圖1 對照品溶液(A)和樣品溶液(B)HPLC色譜

注：1.槲皮素；2.山奈酚

表2 云南產幾種松塔中槲皮素和山奈酚含量測定結果 (mg/g)

3 討論

(1)檢測波長選擇：采用二極管陣列檢測器對槲皮素、山奈酚素對照品混合溶液進行全波長掃描，結果表明槲皮素對照品溶液在372nm波長處有最大吸收峰，山奈酚對照品溶液在368nm波長處有最大吸收峰，結合3D圖譜，兼顧二者選擇360nm為檢測波長。

(2)提取溶劑選擇：本實驗共考察了甲醇-鹽酸(4∶1)、甲醇-25%鹽酸(4∶1) 、甲醇-2mol/L硫酸(4∶1)、甲醇-硫酸(4∶1)四種提取溶劑，結果表明采用甲醇-25%鹽酸( 4∶1)作為提取溶劑時提取效果最優。

(3)流動相系統選擇：本實驗共考察了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸等度和梯度洗脫，結果表明采用乙腈-0.1%磷酸梯度洗脫時分離效果較好。

綜上所述，本研究建立的同時測定松塔中槲皮素與山奈酚含量方法結果準確，重復性良好，對云南產幾種松塔藥材的質量控制有實際應用價值，為進一步制定松塔藥材的質量標準提供了科學依據。

[1] 中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志[M].第7卷.北京:科學出版社,1978:524.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].第1部. 北京:人民衛生出版社,1977:334.

[3] 楊鑫,丁怡,孫志浩,等.松塔化學成分的研究[J].藥學學報,2005,40(5):435-437．

[4] FANG M,LANG C I,CHEN W L,et al. Diterpenoid acids from the leaves of armand pine [J].Phytochemistry,1991,30(8):2793-2795.

[5] 呂永俊,王士賢,彭芳,等.松果有效成分研究—Ⅵ紅松與油松松塔及松子殼的抗癌活性[J].大理學院學報,2008,7(2):1-2.

[6] WATANABE K, MOMOSE F,HANDA H,et al.Interaction between influenza virus proteins and pine cone substance that inhibits the virus multiplication[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,1995,214(2):318-323．

[7] UNTEN S,SAKAGAMI H,KONNO K.Stimulation of granulocytic cell iodination by pine cone antitumor substances[J].Journal of Leukocyte Biology,1989,45(2): 168-375.

(責任編輯：尹晨茹)

Simultaneous Determination of Quercetin and Kaempferol in Pinecone by HPLC

Zhang Zhiqin1, Su Yidong2, Liu Guangming3, Guo Xiangqun1

(1. Pharmacy Department , Chuxiong Medical College, Chuxiong 675005,China; 2.Chuxiong Technology College , Chuxiong 675000,China; 3. College of Pharmacy and Chemistry, Dali University, Dali 671000,China)

Objective:To establish an analytical method on simultaneous determination of queretin and kaempferol in Pinecone.Methods:The sample was determined on InertSustain C18column ( 250mm×4.6mm, 5μm ) . The mobile phase was A (Acetonitrile) -B ( 0.1% phosphoric acid solution ) with gradient elution and the flow rate was 1.0mL/min, the UV detector was set at 360nm.Results:A linear relationship of quercetin was good at the range of 0. 034～0.272μg ( r = 0. 999 9) and kaempferol was good at the range of 0.039～0.317μg ( r=0. 999 8). The average recovery of quercetin was 99.74% (RSD=1.92%) and of kaempferol was 98.33% (RSD=1.36%). Conclusion:The method is accurate, reliable and repeatable with stable result. It can be used as a method of quantitative determination of quercetin and kaempferol in the Pinecone.

Pinecone; Quercetin; Kaempferol; HPLC

2014-07-25

國家自然科學基金資助項目(81260632)；云南省教育廳科學研究基金項目(2012Y328)

張志琴(1979-)，女，白族，楚雄醫藥高等專科學校副教授，研究方向為中藥材及其制劑質量控制。 E-mail: cxyzzzq@163.com

R284.1

A

1673-2197(2014)22-0014-02