HPLC法測定復方桔梗止咳片中甘草苷和甘草酸含量

邰順章，袁步娟，黃柳燕

1鹽城市藥品檢驗所，鹽城 224002；2鹽城師范學院，鹽城 224002

HPLC法測定復方桔梗止咳片中甘草苷和甘草酸含量

邰順章1，袁步娟1，黃柳燕2

1鹽城市藥品檢驗所，鹽城 224002；2鹽城師范學院，鹽城 224002

目的：建立同時測定復方桔梗止咳片中甘草苷和甘草酸含量的HPLC檢測方法。方法：采用Agilent C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）色譜柱；以乙腈-0.05%磷酸為流動相進行梯度洗脫；流速1.0 mL·min-1；檢測波長237 nm；進樣量：10 μL；柱溫30℃。結果：甘草苷、甘草酸分別在10.65～42.60 mg·L-1、97.30～389.30 mg·L-1范圍內呈良好的線性關系，r分別為1.0000、1.0000；平均回收率（n=6）分別為98.80%（RSD=0.73%）、99.84%（RSD=0.10%）。測得6批復方桔梗止咳片，每片分別含甘草苷135.28 μg、123.16 μg、113.21 μg、136.08 μg、160.84 μg、156.32 μg，甘草酸441.36 μg、405.86 μg、364.69 μg、446.93 μg、518.22 μg、509.65 μg。結論：該方法簡便，重復性好，可用于同時測定復方桔梗止咳片中甘草苷和甘草酸的含量。

復方桔梗止咳片；高效液相色譜法；甘草苷；甘草酸；含量測定

復方桔梗止咳片是鎮咳、祛痰的復方中藥制劑，由桔梗、遠志（蜜炙）、款冬花（蜜炙）、甘草4味中藥組成，適用于咳嗽多痰，寒熱癥狀不明顯的患者。甘草具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調和諸藥的作用，是該制劑的主要成分之一。在該制劑中，以甘草的提取物入藥，其主要活性成分為甘草苷和甘草酸?，F行質量標準中沒有收載該藥有效成分含量測定的方法[1]，文獻中用薄層色譜法對該藥主要成分進行定性鑒別[2]和用HPLC法測定甘草酸含量[3]的報道，《中國藥典》[4]及有關文獻載有甘草藥材和飲片中有效成分的含量測定方法[5-8]，也有文獻報道了含甘草的中藥制劑的有效成分含量測定的方法[9-10]。本文對該藥有效成分的測定方法進行探索，建立了HPLC法同時測定復方桔梗止咳片中甘草苷和甘草酸的含量，該法簡便、靈敏、準確、重復性好，為該藥質量控制與評價提供了參考方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

日本島津高效液相色譜系統（島津LC-20A高效液相色譜儀，CTO-20A柱溫箱，SPD-20A紫外檢測器，LC-20AB真空脫氣機，SIL-20A自動進樣器，島津LC-20A色譜工作站）；XS205DU電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；YCQ-300超聲波清洗器（上海凱波超聲設備有限公司）。

1.2 試藥

甘草苷對照品（批號：111610-200604，置五氧化二磷減壓干燥器中干燥12小時使用），中國藥品生物制品檢定所）；甘草酸銨對照品（批號：110731-201317，純度92.6%，干燥同甘草苷，中國食品藥品檢定研究院）；復方桔梗止咳片（通化中辰藥業有限責任公司，規格：每片重0.25 g，批號：20121206、20121208、20121212、20130309；河南羚銳制藥股份有限公司，規格：每片重0.25 g，批號：120619、121208）；乙腈為色譜純；磷酸為分析純；水為重蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備

精密稱取甘草苷對照品10.65 mg，置50 mL量瓶中，加入70%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得甘草苷儲備液；精密稱取甘草酸銨對照品42.68 mg，置于20 mL量瓶中，加入70%乙醇定容至刻度，即得甘草酸銨儲備液（甘草酸重量=甘草酸銨重量/ 1.0207）。分別精密量取上述兩種對照品儲備液各2 mL，用70%乙醇定容至20 mL，即得兩種對照品溶液。

2.2 供試品溶液制備

取本品40片，稱定，研細，精密稱取約15片重，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇100 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Agilent C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：以乙腈為流動相A，以0.05%磷酸溶液為流動相B，按表1中的程序進行梯度洗脫；流速：1.0 mL· min-1；柱溫：30℃；紫外檢測波長：237 nm；進樣量：10 μL。理論板數按甘草苷峰計算應不低于5000，與相鄰組分分離度大于1.5，對照品和供試品色譜圖見圖1和圖2。

表1 流動相梯度洗脫程序

圖1 甘草苷、甘草酸銨對照品色譜圖

圖2 復方桔梗止咳片色譜圖

2.4 線性關系考察

分別精密量取“2.1”項下兩種對照品儲備液1、1.6、2、3、4 mL，用70%乙醇分別定容至20 mL，得系列標準對照溶液，進樣分析。甘草苷以峰面積與濃度進行線性回歸，得回歸方程為：A=21108C-6819，r= 1.0000（n=5），表明甘草苷濃度在10.65～42.60 mg·L-1范圍內與峰面積呈良好線性關系；甘草酸以峰面積與濃度進行線性回歸，得回歸方程為：A=5880.4C-4970，r=1.0000（n=5），表明甘草酸濃度在97.30～389.30 mg·L-1范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.5 精密度試驗

取同一對照品溶液，連續進樣6次，甘草苷、甘草酸峰面積的RSD分別為0.13%、0.14%，表明儀器精密度良好。取批號為20121206的樣品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣分析：平均每片中甘草苷的含量（μg）分別為134.96、135.00、135.82、135.18、134.76和136.98，平均135.45；平均每片中甘草酸的含量（μg）分別為439.72、439.45、439.44、440.81、441.62和442.63，平均440.61；RSD分別為0.63%、0.81%（n=6），表明該方法重復性良好。

2.6 穩定性實驗

取批號為20121206的供試品溶液，室溫下放置，每隔3 h進樣一次，測定6次，甘草苷、甘草酸峰面積的RSD分別為0.9%、0.71%（n=6），結果表明供試品溶液室溫放置15 h內穩定。

2.7 加樣回收率試驗

精密量取對照品儲備液2 mL，置于20 mL量瓶中，共6份，用批號為20121206樣品的供試品溶液定容至刻度，進樣分析，測定回收率，結果見表2。表明復方桔梗止咳片用本法測定回收率良好。

表2 加樣回收試驗結果（n=6）

2.8 供試品含量測定

取供試品溶液，濾過，進樣，測定。用回歸方程計算供試品的含量，測定6批樣品，每批樣品測定2次，結果見表3。

3 討論

3.1 樣品提取溶劑和提取時間的選擇

根據有關文獻介紹比較了水、70%甲醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇進行超聲提取實驗，結果表明用70%乙醇提取效率最高。比較了不同提取時間（15、20、30、40、60 min）對提取效果的影響，結果表明超聲30 min已基本將兩種組分提取完全。

表3 供試品含量測定結果（%，n=6）

3.2 樣品提取方法的選擇

本實驗對冷浸、超聲提取、回流提取、索氏提取4種方法進行了考察，結果表明超聲提取對兩種組分的提取效率都較高，同時超聲提取時間短、操作簡便易行，故樣品制備方法采取用70%乙醇超聲提取30 min。

3.3 根據相關文獻采用的流動相情況，實驗中分別考察了乙腈-水、甲醇-水、乙睛-0.5%醋酸和0.05%磷酸溶液-乙腈4種流動相系統的分離效果，結果表明以乙腈為流動相A，0.05%磷酸溶液為流動相B進行梯度洗脫，兩組分峰形對稱且分離度好，避免了該藥其它組分的干擾，且不會對色譜柱產生負面影響。本實驗在《中國藥典》[4]梯度程序基礎上優化了梯度比例，大大縮短了洗脫時間，且避免了因流動相比例變化幅度過大產生的溶劑峰。

[1] 衛生部.部頒標準中藥成方制劑（第4冊）[S].1991：121.

[2] 簡淑娟，翁雪萍.復方桔梗止咳片的薄層色譜鑒別[J].廣東藥學，2001，11（6）：29-30.

[3] 韋向紅.HPLC法測定復方桔梗止咳片中甘草酸的含量[J].廣西中醫學院學報，2006，9（2）：67-9.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：化學工業出版社，2010：80-1.

[5] 何三民，石森林.HPLC法測定甘草中甘草素、異甘草素、甘草苷的含量[J].中草藥，2004，34（7）：618-9.

[6] 付玉杰，祖元剛，趙春建，等.RP-HPLC法測定甘草中甘草苷和異甘草苷的含量[J].中草藥，2004，35（5）：576-7.

[7] 呂歸寶，劉軍.HPLC法測定甘草及其制劑中甘草酸的含量[J].藥物分析雜志，1998，8（3）：137.

[8] 崔淑芬，張信青，許柏球，等.高效液相色譜法同時測定甘草中甘草酸和甘草苷的含量[J].時珍國醫國藥，2006，17（3）：307-8.

[9] 趙曉莉，崔小兵，吳皓，等.HPLC雙波長法測定復方甘草合劑中甘草苷、甘草素及異甘草素的含量[J].中成藥，2002，24（3）：175.

[10] 王征，夏宇欣.HPLC法測定腦樂靜中甘草酸銨的含量[J].基層中藥雜志，2001，15（2）：11.

HPLC Method for Determination of Liquorice Glycosides and Glycyrrhizic acid Content in the Compound Radix Platycodi Cough Tablets

TAI Shun-zhang1,YUN Bu-juan1,HUANG Liu-yan2
1Yancheng Institute for Drug Control,Yancheng 224002;2Yancheng Normal College,Yancheng 224002

Objective：To establish a quantitative method for the determination of licorice glycosides and glycyrrhizic acid in the compound radix platycodi cough tablets by high-performance liquid chromatography (HPLC)coupled with ultraviolet detection.Methods：An Agilent C18column(4.6 mm×150 mm,5 μm)was adopted.The mobile phase consisted of a mixture of acetonitrile-0.05%phosphoric acid in gradient elution at a flow rate of 1.0 mL·min-1,the detection wavelength was set at 237 nm;The sampling volume was 10 μL;The column temperature was 30℃.Results：The calibration curve showed a good linearity in the range of 10.65～42.60 mg·L-1(r=1.0000)for licorice glycosides and 97.30～389.30 mg·L-1(r=1.0000)for glycyrrhizic acid,respectively.The average recoveries(n=6)of licorice glycosides and glycyrrhizic acid were 98.80%(RSD=0.73%)and 99.84%(RSD=0.10%),respectively.Six batches of compound radix platycodi cough tablets were measured and the content per pill was respectively as follows:liquorice glycosides, 135.28 μg,123.16 μg,113.21 μg,136.08 μg,160.84 μg and 156.32 μg;glycyrrhizic acid,441.36 μg,405.86 μg,364.69 μg,446.93 μg,518.22 μg and 509.65 μg.Conclusions:The developed method is simple and reproducible,which can be used for the quantitative determination of licorice glycosides and glycyrrhizic acid in the compound radix platycodi cough tablets.

Compound radix platycodi cough tablets;Licorice glycosides;Glycyrrhizic acid;Content determination;Assay

R927.2

A

1673-7806（2014）02-115-03

邰順章，男，副主任藥師 E-mail:417677528@qq.com

2013-12-18

2014-02-12