前列地爾脂微球注射液中游離藥物濃度測定方法研究

馬玉樊，盧婷利，崔 晗，周四元，陳 濤，

（1.西北工業大學生命學院，陜西 西安 710072； 2.中國人民解放軍第四軍醫大學，陜西 西安 710032）

前列地爾即前列腺素 E1（PGE1），是一種廣泛存在于體內的生物活性物質，具有舒張血管平滑肌、改善血液循環、調血脂、降低血黏度及一定的直接溶栓作用。將其制備成制劑，在治療糖尿病神經病變及腦血管病領域中得到了廣泛應用。PGE1在水溶液中易水解，分散于水溶液中的PGE1在體內能被快速滅活，故無法產生預期的治療效果。PGE1可很好地分散在油相中，據此特性將其開發成為前列地爾脂微球（Lipo-PGE1）制劑，成功克服了PGE1水針劑穩定性差以及體內代謝快的缺點[1-3]。Lipo-PGE1可有效地將PGE1輸送到血管病變部位，使局部藥物濃度顯著升高，產生良好的治療效果[4]。目前Lipo-PGE1制劑的質量標準中僅要求對藥物含量進行測定，但對于脂微球包裹藥物的量和游離藥物并未作出相關的技術要求。大量研究顯示，Lipo-PGE1中游離的PGE1含量是決定PGE1藥效強度及不良反應的最重要因素。本試驗中建立了檢測Lipo-PGE1中游離PGE1含量的方法，分別采用不同規格的超濾膜、以不同離心速率對前列地爾脂微球樣品進行處理，分別檢測了目前市售不同廠家的Lipo-PGE1制劑，并在此基礎上建立了一種可快速準確分析Lipo-PGE1制劑中游離PGE1含量的新方法。

1 儀器與試藥

離心機（Beckman coulter， Microfuge 22R centrifuge）； Waters Quattro Premier型號液質聯用系統，馬爾文Zeta激光粒度和ZETA電位儀；Millipore超濾離心管3K，10K，30K（上海肯強儀器有限公司）。前列地爾注射液（樣品1，商品名為凱時，北京泰德制藥有限公司，批號為2010N，規格為2 mL∶10μg；樣品2，商品名為喜通，西安力邦制藥有限公司，批號為1012281，規格為 2 mL∶10μg）。前列地爾標準品（上海瑞齊生物科技有限公司，批號為140659，規格為每支8mg）；甲醇、乙腈為色譜純。

2 方法與結果

2.1 Lipo-PGE1樣品表征

取Lipo-PGE1樣品，用超純水稀釋1 000倍，用激光粒度儀檢測平均粒徑。取Lipo-PGE1樣品100μL，置10 mL容量瓶中，用甲醇破乳定容，制成50 ng/mL甲醇溶液，液質聯用檢測樣品中PGE1，響應值帶入標準曲線計算 PGE1含量。結果見表1。可見，樣品1、樣品2脂微球的粒徑和含量接近。

表1 不同Lipo-PGE1樣品粒徑、含量檢測結果

2.2 樣品處理方法

超濾膜分子量的選擇:分別移取樣品1 500μL，置3，10，30 K分子量超濾離心管中，配平，以5 000 r/min的速率 4℃離心30 min，觀察下清液外觀，量取下清液體積。結果見表2。可見，使用3 K分子量超濾管離心，分子量過小，離心下清液體積過少，不易檢測含量；30 K分子量超濾管分子量過大，有小分子量的乳滴離心到下清液中，影響含量的測定。故選定10 K分子量的超濾管。

離心速度的選擇:分別移取樣品1 500μL，置10 K分子量超濾離心管中，配平后置離心機中以3 000，5 000，8 000 r/min的速率4℃各離心30 min，觀察下清液外觀，量取下清液，液質聯用檢測，每個轉速下處理3個樣品，測定吸收峰面積，最后取平均值。結果見表 3。可見，3000 r/min 轉速過低，無下清液離出；8 000 r/min轉速下離心下清液中游離PGE1含量測定的重現性不好，可能是由于轉速過高有少量的小分子量的乳滴離出；5 000 r/min轉速下離心下清液中游離PGE1含量測定重現性好，較穩定。因此，轉速取 5 000 r/min。

表2 使用不同分子量的超濾管離心下清液情況

表3 不同轉速下離心Lipo-PGE1下清液情況

2.3 樣品中游離藥物含量測定

2.3.1 檢測條件

色譜條件:色譜柱為 Xterra MS C18柱（150 mm×2.1 mm，5 μm）；流動相為乙腈 -水(85 ∶15)；流速為 0.3 mL/min；柱溫室溫；進樣量 2μL。

質譜條件:電噴霧電離源（ESI），以選擇反應離子監測（SRM）方式進行檢測；電噴霧電壓為3.5 kV，加熱毛細管溫度為350℃，鞘氣（N2）流速為 10.0 L/min，輔助氣（N2）流速為 1.7 L/min，碰撞氣（Ar）壓力為0.1 Pa；碰撞能量為12 eV；用于定量分析的反應離子為 m/z353.0 → 317.0，掃描時間為 0.1 s。

2.3.2 樣品檢測方法

樣品1、樣品2各取500μL，置一定分子量的超濾離心管內，配平，以5 000 r/min的速率4℃離心30min，取下清液液質聯用檢測游離PGE1質量濃度，每個樣品處理3個平行樣品，檢測后取平均值。

2.3.3 方法學考察

專屬性考察:PGE1在擬訂的色譜條件下出峰良好，出峰時間為 1.38 min，見圖 1。離心下清液中其他成分不干擾 PGE1的測定，故方法具有較強的專屬性。

圖1 高效液相色譜圖

線性關系考察:精確稱取25 mg PGE1標準品，置25 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，制備1 g/L的PGE1溶液。然后用甲醇稀釋制備 1 μg/mL 的 PGE1貯備液。移液槍分別量取 10，20，30，40，50，60，80μL 的 1μg/mL 的 PGE1貯備液，再量取一定量的甲醇定容至 1mL，則分別制得 10，20，30，40，50，60，80 ng/mL 的 PGE1標準溶液。取各標準溶液進樣檢測，以樣品響應值為縱坐標，PGE1標準溶液濃度為橫坐標做圖，得線性方程為 Y＝5.758 6X+7.127 5，r＝0.997 2(n＝7)。結果表明，前列地爾質量濃度在 5 ～60 ng/mL范圍內與峰面積線性關系良好。以 S/N＞3計，最低檢出限為5 ng/mL。取50 ng/mL的前列地爾標準品溶液，連續進樣分析6次，測定響應值，計算得響應值的 RSD為0.73%。

穩定性試驗:取同一份離心下清液樣品，分別于 0，1，2，3，4，5 h時按擬訂色譜條件進樣，測定峰面積。結果的 RSD為0.43%(n＝6)，說明供試品在5 h內穩定。

重復性試驗:取同一批樣品6份，按照樣品處理過程離心取下清液，測定 PGE1含量。結果的 RSD為0.96%，表明方法重現性良好。

加樣回收試驗:精密吸取空白脂肪乳離心下清液適量，精確加入PGE1標準品溶液適量，使其最終質量濃度為含量測定中樣品濃度的80%，100%，120%，每個濃度制備3個樣品，依法測定。結果其平均回收率分別為 96.3%，97.1%，95.9%，RSD 分別為 1.01% ，0.70% ，0.93% 。

2.3.4 游離 PGE1濃度檢測結果

取Lipo-PGE1樣品100μL，置10 mL容量瓶中，用甲醇破乳定容，制成50 ng/mL甲醇溶液，液質聯用檢測樣品中 PGE1，把檢測到的樣品響應值帶入標準曲線中，計算得游離前列地爾的質量濃度，結果見表4。可見，樣品1中游離PGE1含量顯著大于樣品2。

表4 不同PGE1樣品中游離藥物檢測結果

3 討論

大量研究顯示，Lipo-PGE1中游離的PGE1含量是決定PGE1藥效強度的最重要因素。Yamauchi等[6]發現，Lipo-PGE1的治療效果會隨著其游離PGE1含量的改變而相應改變。Yukiko等[7]人分別用生理鹽水和脂肪乳稀釋的Lipo-PGE1進行大鼠試驗，結果發現用生理鹽水稀釋的Lipo-PGE1藥效降低，而用脂肪乳稀釋的Lipo-PGE1藥效不變。關于這一現象的解釋有2種:一者可能是由于PGE1在生理鹽水中不穩定，但已有研究表明PGE1在20℃生理鹽水中放置9 d后，僅有極少量的PGE1分解[8]，90%的PGE1仍穩定存在。另外一種解釋是當用生理鹽水或其他水溶液稀釋Lipo-PGE1時PGE1從脂肪乳中釋放出來的速率增加[9]，結合的PGE1量減少，因此輸送到病變部位的PGE1量減少，藥效降低。研究發現，Lipo-PGE1用生理鹽水稀釋10倍后包合的PGE1量迅速減少了53.2%，而用脂肪乳稀釋的 Lipo-PGE1中包合的PGE1量僅損失了13%[10]。

2010年版《中國藥典(二部)》收載的PGE1檢測方法為經氫氧化鈉異構化后采用高效液相色譜在214 nm波長處檢測[11-12]。該方法堿異構化耗時較長，樣品處理條件要求高，經過衍生處理后樣品分析靈敏度受限，因此無法實現對Lipo-PGE1中游離PGE1含量的檢測，且目前國內外文獻并無相關檢測方法的報道。考慮到Lipo-PGE1中游離PGE1含量對Lipo-PGE1制劑藥效影響，開發出了檢測 Lipo-PGE1中游離PGE1的方法。該方法采用膜分離技術將脂微球注射液進行相分離，通過驗證確認適合相分離的膜材孔徑，并且考察了分離轉速對分離效果的影響。經方法學驗證確認，該方法科學簡便、檢測高效、靈敏度高。

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