高效液相色譜法測(cè)定鹽酸瑞伐拉贊的有關(guān)物質(zhì)

蒲小琴 ，曾 巧 ，徐 溢

(1．重慶科技學(xué)院，重慶 401331;2．重慶大學(xué)，重慶 400030;3．重慶醫(yī)藥工業(yè)研究院有限責(zé)任公司，重慶 400061)

鹽酸瑞伐拉贊(revaprazan hydrochloride)為新一代可逆質(zhì)子泵抑制劑(PPI)，也是全球唯一上市的鉀競(jìng)爭(zhēng)性酸泵抑制劑或酸泵拮抗劑，主要用于治療十二指腸潰瘍和胃炎、急性胃炎、慢性胃炎以及胃癌病灶的改善和短期治療消化性潰瘍。與傳統(tǒng)PPI不同的是，其通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制質(zhì)子泵(即H+，K+－ATP酶)中的K+而起作用，是一種可逆的鉀拮抗劑。由于鹽酸瑞伐拉贊抑酸效果和質(zhì)子泵活化情況無(wú)關(guān)，臨床可明顯減少夜間酸突破的發(fā)生。同時(shí)，由于其具有親脂性、弱堿性、解離常數(shù)高和在低pH時(shí)穩(wěn)定的特點(diǎn)，故在酸性環(huán)境下立刻離子化，通過(guò)離子型結(jié)合抑制H+，K+－ATP酶，不需要集中于胃壁細(xì)胞的微囊和微管及酸的激活，能迅速升高胃內(nèi)pH，而在離解后酶活性能得到有效的恢復(fù)，在治療劑量時(shí)對(duì)其他酶影響很小，對(duì)機(jī)體生理功能的影響也非常小。鹽酸瑞伐拉贊對(duì)胃消化性潰瘍具有良好的治療作用和較少的不良反應(yīng)，在消化性潰瘍領(lǐng)域的潛力及市場(chǎng)需求將非常巨大[2－4]。通過(guò)文獻(xiàn)及專利檢索發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)及專利資料中，僅有1篇報(bào)道采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定其體外溶出度[5]，1篇報(bào)道采用液－質(zhì)聯(lián)用(LC－MS)方法測(cè)定其血漿藥物濃度[6]，未見(jiàn)有雜質(zhì)控制方面的報(bào)道。鹽酸瑞伐拉贊中可能含有3種雜質(zhì)(雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C)，有關(guān)物質(zhì)是影響產(chǎn)品質(zhì)量及安全性最重要的指標(biāo)，故建立一種能有效控制產(chǎn)品中有關(guān)物質(zhì)含量的檢測(cè)方法勢(shì)在必行。本研究中針對(duì)此新型化合物開(kāi)發(fā)有關(guān)物質(zhì)的質(zhì)控方法，以高效液相色譜系統(tǒng)為測(cè)試體系，建立了以磷酸氫二鈉－乙腈為分離體系、高靈敏度的有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Dionex U3000型高效液相色譜儀(多波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器)，Chromeleon色譜工作站(Dionex公司);Agilent 8453型紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì);電子天平(Mettler Toledo公司);PB－10精密pH計(jì)(德國(guó)賽多利斯公司)。鹽酸瑞伐拉贊(批號(hào)為 RF2014001，RF2014002，RF2014003)，雜質(zhì) A(1 － 甲基 －1，2，3，4 － 四氫異喹啉，批號(hào)為 YKL－201402001)，雜質(zhì) B[4－羥基 －2－(4－氟苯胺)－5，6－二甲基嘧啶，批號(hào)為 QJ－201402001]，雜質(zhì) C[4－氯 －2－(4－氟苯胺)－5，6－二甲基嘧啶，批號(hào)為 LD－201402001]均由重慶福美達(dá)科技有限公司提供，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1[7－9];磷酸氫二鈉、磷酸為分析純，乙腈為色譜純，水為超純水。

圖1 鹽酸瑞伐拉贊及其雜質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱:Inertsil－ C8柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm);流動(dòng)相:0．01 mol/L磷酸氫二鈉溶液(用磷酸調(diào)pH為4．0)－乙腈(30∶70);檢測(cè)波長(zhǎng):205 nm;流速:1．0 mL/min;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。理論板數(shù)以瑞伐拉贊峰計(jì)不得低于5 000，主峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)大于1．5。

2．2 溶液制備

取鹽酸瑞伐拉贊適量，加70%乙腈水溶液溶解并稀釋制成質(zhì)量濃度為0．6 g/L的溶液，即得供試品溶液。精密量取供試品溶液0．5 mL，置100 mL容量瓶中，加70%乙腈水溶液稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照溶液(約 3 μg/mL)。

2．3 測(cè)定法

精密量取對(duì)照溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的10% ～20%。再精密量取供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，同時(shí)做溶劑空白試驗(yàn)。供試品溶液中如顯雜質(zhì)峰，以峰面積按稀溶液自身對(duì)照法進(jìn)行計(jì)算。

2．4 方法學(xué)考察

2．4．1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別精密稱取雜質(zhì)A，B，C及鹽酸瑞伐拉贊適量，加70%乙腈水溶液溶解并稀釋制成每1 mL中約含0．6 mg鹽酸瑞伐拉贊、12 μg雜質(zhì)A，12 μg 雜質(zhì) B，12 μg質(zhì)雜 C 的混合溶液，作為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液。精密量取10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。理論板數(shù)以瑞伐拉贊峰計(jì)為13 500，主峰與各雜質(zhì)峰、各雜質(zhì)間的分離度均大于 1．5(分離度 r=6．48，16．99，17．62)，見(jiàn)圖2。

圖2 高效液相色譜圖

2．4．2 專屬性試驗(yàn)

對(duì)本品分別進(jìn)行強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫、強(qiáng)氧化、強(qiáng)光照的降解試驗(yàn)(供試品溶液質(zhì)量濃度約為0．6 g/L)，考察鹽酸瑞伐拉贊與各降解產(chǎn)物的分離情況，同時(shí)也考察鹽酸瑞伐拉贊在各條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果見(jiàn)圖3。可見(jiàn)，各降解條件下的降解產(chǎn)物均能與鹽酸瑞伐拉贊達(dá)到基線分離，不干擾有關(guān)物質(zhì)測(cè)定，且雜質(zhì)之間也得到了較好分離，陰性無(wú)干擾。該方法專屬性強(qiáng)，適用于鹽酸瑞伐拉贊中有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定。另外，鹽酸瑞伐拉贊對(duì)強(qiáng)堿、強(qiáng)光照、強(qiáng)氧化條件均較穩(wěn)定，強(qiáng)酸條件下略有降解，較高溫度條件下較其他條件更敏感。

2．4．3 檢測(cè)限及定量限試驗(yàn)

取鹽酸瑞伐拉贊適量，加70%乙腈水溶液溶解并稀釋制成質(zhì)量濃度為1 μg/mL(相當(dāng)于供試品溶液的0．2%)的供試品溶液。精密量取10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，同時(shí)采集基線噪聲，以3倍噪聲計(jì)算檢測(cè)限，10倍噪聲計(jì)算定量限。檢測(cè)限為 0．09 μg/mL(S/N=3，相當(dāng)于供試品溶液的 0．015%)，定 量 限 為 0．30 μg/mL(S/N=10，相 當(dāng) 于 供 試 品 溶 液 的0．05%)。

2．4．4 精密度試驗(yàn)

精密量取對(duì)照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，以峰面積計(jì)算 RSD。結(jié)果的 RSD為0．81%，表明儀器精密度好。

2．4．5 線性關(guān)系考察

取本品適量，用70%乙腈水溶液稀釋配制成質(zhì)量濃度為0．3，0．6，1．2，3．0，5．0，6．0 μg/mL 的系列溶液，分別相當(dāng)于供試品溶液的 0．05% ，0．10% ，0．20% ，0．50% ，0．80% ，1．0% 。精密量取上述溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程 A=2．186 6+41．940 2 C，r=0．999 8(n=6)。結(jié)果表明，稀溶液質(zhì)量濃度在0．3～6 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，符合稀溶液自身對(duì)照法的測(cè)試要求。

圖3 專屬性試驗(yàn)高效液相色譜圖

2．4．6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取同一供試品溶液，分別于 0，6，9，12，18，24 h 時(shí)精密量取10 μL，注入高效液相色譜儀，以峰面積歸一化法計(jì)算有關(guān)物質(zhì)。結(jié)果供試品溶液主峰面積的 RSD為1．86%，單個(gè)雜質(zhì)的RSD為8．45%，總雜質(zhì)的 RSD為8．90%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定。

2．4．7 重復(fù)性試驗(yàn)

取鹽酸瑞伐拉贊適量，依法制備供試品溶液與對(duì)照溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，重復(fù)6次。結(jié)果單個(gè)雜質(zhì)的 RSD為5．71%，總雜質(zhì)的 RSD為6．35%，表明方法重復(fù)性良好。

2．4．8 耐用性試驗(yàn)

色譜柱:取高溫降解試驗(yàn)供試品溶液，分別選用兩根不同的Inertsil－C8柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm)，按擬訂色譜條件進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果在不同編號(hào)的Inertsil－C8色譜柱上理論板數(shù)及分離度無(wú)明顯變化，理論板數(shù)均大于5 000，分離度均大于1．5，表明方法對(duì)色譜柱的耐用性好。

緩沖液pH:取高溫降解試驗(yàn)供試品溶液，分別在緩沖液pH為 3．9，4．0，4．1 的條件下，按擬訂色譜條件進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果在不同pH的緩沖液條件下理論板數(shù)及分離度無(wú)明顯變化，理論板數(shù)均大于5 000，分離度均大于1．5，表明方法對(duì)pH的耐用性好。

柱溫:取高溫降解試驗(yàn)供試品溶液，分別在柱溫為30，35，40℃條件下，按擬訂色譜條件測(cè)試。結(jié)果在不同柱溫條件下理論板數(shù)及分離度無(wú)明顯變化，理論板數(shù)均大于5 000，分離度均大于1．5，表明本方法對(duì)柱溫的耐用性好。

流動(dòng)相比例:取高溫降解試驗(yàn)供試品溶液，分別在磷酸氫二鈉－乙腈比例為35∶65，30∶70，25∶75的條件下，按擬訂色譜條件進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果在不同的流動(dòng)相比例條件下理論板數(shù)及分離度無(wú)明顯變化，理論板數(shù)均大于5 000，分離度均大于1．5，表明方法對(duì)流動(dòng)相在一定范圍內(nèi)比例變化的耐用性好。

2．5 樣品測(cè)定

按擬訂色譜條件，對(duì)3批鹽酸瑞伐拉贊進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)測(cè)定，結(jié)果表明，建立的方法可滿足實(shí)際分析的需要，見(jiàn)表1。3批樣品中雜質(zhì)A，B，C均未檢出，單一未知雜質(zhì)均小于0．15%，總雜質(zhì)均小于 0．3%。

表1 3批樣品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

3 討論

檢測(cè)波長(zhǎng)的確定:根據(jù)鹽酸瑞伐拉贊的紫外光譜圖可知，其在205，271，304 nm波長(zhǎng)處均有特征吸收峰，故在此3個(gè)波長(zhǎng)條件下同時(shí)對(duì)供試品溶液進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定結(jié)果顯示，在205 nm波長(zhǎng)條件下能更有效地檢測(cè)產(chǎn)品中各微量雜質(zhì)，特別是雜質(zhì)A。通過(guò)專屬性試驗(yàn)進(jìn)一步證明，采用205 nm波長(zhǎng)能有效檢測(cè)各降解產(chǎn)物。因此，選擇205 nm作為鹽酸瑞伐拉贊中有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定波長(zhǎng)。

流動(dòng)相的確定:以磷酸鹽緩沖液(pH為2．5～7．0)進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)緩沖液pH為4．0時(shí)峰形對(duì)稱、柱效最高，且以磷酸氫二鈉為緩沖液效果最佳。以甲醇、乙腈為有機(jī)相進(jìn)行了試驗(yàn)，以乙腈為流動(dòng)相效果更好。因此，選擇磷酸氫二鈉－乙腈為流動(dòng)相可行。

進(jìn)樣量的確定:取含0．6 g/L的鹽酸瑞伐拉贊溶液，分別進(jìn)樣8，10，20 μL，供試品溶液中雜質(zhì)檢出量基本一致。且當(dāng)進(jìn)樣量為10 μL時(shí)，檢測(cè)限達(dá)到了0．015%，靈敏度滿足測(cè)試要求，故選擇10 μL作為進(jìn)樣量。

本試驗(yàn)中建立了測(cè)定鹽酸瑞伐拉贊中有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜法，該方法靈敏度高、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，能快速同時(shí)測(cè)定鹽酸瑞伐拉贊中3個(gè)已知雜質(zhì)及其他未知雜質(zhì)，滿足質(zhì)控的要求。其自主開(kāi)發(fā)的首創(chuàng)性為該產(chǎn)品的質(zhì)量控制及質(zhì)量研究奠定了基礎(chǔ)。

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